I. Introducción

La secuenciación del genoma humano y de otros organismos está generando una enorme masa de información biológica y biomédica muy útil para la comunidad científica. La lectura directa de dicha información proporciona datos cualitativos y cuantitativos de nuestra herencia genética. Sin embargo, los genomas serían sólo herramientas de lectura evolutiva si no supiéramos cómo se integra y modula esa información en el desarrollo, funcionamiento y patologías de un organismo. En la era postgenómica, nos hace falta saber cómo se manifiesta esa información genética en las redes interactómicas de biomoléculas a nivel celular y tisular, especialmente para las proteínas. Este es y va a seguir siendo un arduo y largo trabajo interdisciplinario que requiere una visión global y una coordinación de la información obtenida basándose sobre todo en la biología de sistemas, la proteómica y la quimiogenómica.

En lo que sigue vamos a presentar unas breves pinceladas respecto a la última de dichas subdisciplinas de la genómica, la quimiogenómica, que confronta dos "universos" moleculares muy complejos, el de las grandes macromoléculas (y especialmente de las proteínas y sus variantes) con el de las pequeñas moléculas (naturales o sintéticas). Las segundas pueden afectar a las primeras, regulando su estructura y actividad, en acciones de enorme interés biológico y biotecnológico-biomédico. Desarrollaremos una línea central en este ámbito en el marco de un proyecto financiado por el 6º Programa Marco de la Comisión Europea (Chemical Genomics by Activity Monitoring of Proteases “CAMP”), del que nuestro grupo coordina un consorcio involucrando a otras cinco entidades académicas y dos empresas europeas (ver http://camp.bioinfo.cipf.es/)

II. La Quimiogenómica, en la interfase entre Química, Genómica y Medicina

La Química genómica o quimiogenómica es una de las "ómicas" más recientes^1-3, aunque como otras de dichas disciplinas hermanas recupera e integra conocimientos y estrategias previas en el contexto del conocimiento postgenómico. En este caso, pretende usar pequeñas moléculas (generalmente de síntesis química) para de manera masiva ("highthroughput" -HT) identificar y analizar la estructura, funcionalidad y localización de grandes biomoléculas biológicas in vivo, en su entorno celular y/o tisular. Y ello con una visión dinámica, como son los seres vivos. Alternativamente, en un enfoque terapéutico-biomédico, la quimiogenómica persigue el objetivo de afectar la función de macromoléculas clave en patologías y permitir el diseño racional de fármacos específicos por integración de dichos conocimientos.

Aunque esta estrategia de síntesis de moléculas-ligando específicas se está también aplicando para ácidos nucleicos u otras macromoléculas biológicas³, las proteínas constituyen la mayor parte de las dianas actuales de la quimiogenómica por su enorme variedad e importancia en el funcionamiento de los seres vivos y en sus patologías. A pesar de ello, el término quimioproteómica es todavía menos frecuente en su uso que el más general de quimiogenómica.

La quimiogenómica intenta desarrollar moléculas relativamente pequeñas que se unan específicamente -generalmente de manera irreversible- a determinados genes o a sus productos, habitualmente proteínas, in vivo para evaluar o afectar su función. Ello requiere que posean una muy alta capacidad de discriminación de ligandos, ya que deben actuar en medios con una enorme variedad de otras dianas competidoras y que, en algunos casos, puedan penetrar a través de membranas y orgánulos celulares.

Los compuestos químicos sintetizados suelen llevar incorporados grupos químicos "marcadores" que facilitan la obtención de imágenes (imaging) de la localización y actividad de las dianas en procesos normales y patológicos (Figura 1). Esta variante técnica, conocida como activity-based protein profiling (identificación de proteínas a través de su actividad), permite la monitorización de la actividad funcional de las proteínas diana (p.e. su actividad enzimática) y su análisis profundo mediante técnicas de imagen muy sensibles (in vivo, visualización tridimensional, dinámica, etc)^4,5 . Ello además facilita su transformación en "ligandos de interés clínico o terapéutico" o la derivación de compuestos líder (cabezas de serie o lead compounds) para generar fármacos que actúen sobre sus dianas clínicas o terapéuticas^6,7.

Dichas estrategia exigen generalmente, y en especial cuando se persiguen aplicaciones clínicas o terapéuticas, salvar uno de los cuellos de botella más agudos de la quimiogenómica, consistente en la selección inicial de un compuesto cuya unión sea suficientemente específica a la diana (o dianas) entre los millones de compuestos que se encuentran en las quimiotecas actuales (reales o virtuales), así como la optimización final de su unión y capacidad de discriminación.

Aquí es donde el contexto genómico (hasta ahora no comentado) realiza uno de sus mayores aportaciones: el establecimiento de homologías secuenciales o de estructuras tridimensionales, incluso lejanas, mediante comparaciones de bases de datos genómicos utilizando algoritmos bioinformáticos complejos que permiten trasladar propiedades de unión de compuestos químicos prometedores desde una diana proteica bien conocida a otra desconocida con la que se está trabajando. Por ello se están clasificando "patrones" de reconocimiento y de acción (p.e. de unión inhibidora) de multitud de tipos de compuestos químicos para familias o subfamilias de proteínas (o incluso para motivos estructurales proteicos). Dado que el universo secuencial y estructural proteico (proteómico) cada vez es más conocido, esta estrategia permite reducir muy significativa y racionalmente el número de miembros de quimiotecas a explorar experimentalmente en las búsquedas de fármacos y de sus compuestos líderes previos. Dado el pequeñísimo porcentaje de fármacos potenciales que hasta ahora suelen pasar los controles experimentales iniciales, medios y finales de su proceso de desarrollo, y el enorme coste de dichos controles, la llegada de estas estrategias de ayuda quimiogenómica están siendo consideradas como una revolución en farmacología^6,7. Y tanto o más importante es la ayuda que la quimiogenómica podría aportar al descarte de fármacos potenciales que puedan tener efectos secundarios perniciosos⁶, un tema de enorme preocupación para la industria farmacéutica.

III. Aplicaciones de la Quimiogenómica al Estudio in vivo de Enzimas Proteolíticos y sus Inhibidores.

Las enfermedades cardiovasculares, la inflamación, la osteoporosis, la artritis reumatoide, la osteoartritis, las enfermedades neurológicas y autoimmunes se pueden diagnosticar, en algunos casos pronosticar y pueden beneficiarse de la selección de estrategias terapéuticas como resultado de aplicaciones de la quimogenómica, ya que su aparición está influida en muchos casos por la desregulación de distintos tipos de enzimas, entre los que destacan las proteasas ^8,9. Hoy en día es factible, aunque no fácil aún, desarrollar métodos de selección de compuestos químicos a partir de quimiotecas que sirvan tanto de marcadores de proteasas para la detección precoz de la patología correlacionda ellas como de inhibidores de su acción desregulada^10-12.

Las proteasas son moléculas fundamentales en numerosos procesos celulares y fisiológicos, ya que activan o inactivan otras proteínas mediante proteólisis limitada o degradación completa. El análisis bioinformático indica la existencia de más de 600 genes que codifican para proteasas diferentes en el genoma humano (y de una cantidad también importante de sus inhibidores endógenos), con lo cual constituyen una fracción importante del complemento génico y del proteoma derivado^13-15.

Se clasifican en seis tipos catalíticos según su mecanismo enzimático: serin-, treonin-, cistein-, aspartico-, glutámico y metalo-proteasas. Estos tipos se subdividen a su vez en varios clanes y numerosas familias según la homología existente entre sus secuencias y entre sus estructuras tridimensionales, según se recoge en la base de datos general MEROPS¹⁵. Todas ellas hidrolizan enlaces peptídicos generando proteínas más pequeñas y/o péptidos.

En condiciones normales su actividad está regulada de manera muy precisa, y juegan un papel fundamental en muchos procesos celulares y fisiológicos, mediante la activación o inactivación de proteínas por proteolisis limitada o por degradación de la proteína⁸. Sin embargo, ¿qué ocurre cuando su actividad se desregula ya sea por desregulación génica, mal procesamiento post-trasducció o desregulación celular? Numerosas patologías como la osteoporosis, la artritis reumatoide, la osteoartritis, enfermedades vasculares, neuronales y cáncer presentan una mala regulación de proteasas, ya sea en sus inicios acelerando la enfermedad, o como un proceso final al que se ve abocado el sistema enfermo, en el que la acción descontrolada de las proteasas termina por destruir el material biológico.

No es de extrañar el gran interés que existe en las proteasas como dianas terapéuticas y como excelentes modelos para el desarrollo de la quimiogenómica, ya que su actividad enzimática es fácil de monitorizar al producirse cambios estructurales muy importantes en los sustratos sobre los cuales actúan; y mediante el uso de sustratos modificados con los marcadores adecuados resulta relativamente fácil monitorizar su actividad, así como diseñar inhibidores y monitorizar su efecto^4,16-18.

Algunos ejemplos de moléculas terapéutica s que existen en el mercado desarrolladas a partir de la quimiogenómica y aplicadas a las proteasas son, por ejemplo, los inhibidores sintéticos de las cisteínas proteasas ICE para el tratamiento de síntomas reumáticos, inhibidores sintéticos de la catepsina K para el tratamiento de la osteoporosis, inhibidores de la metaloproteasa convertidora de la angiotensina (ACE) para el tratamiento de la hipertensión y los inhibidores de la proteasa aspártica del virus de immunodeficiencia adquirida para el tratamiento del SIDA entre muchos otros (Tabla 1).

Tabla 1. Algunas moléculas naturales o sintéticas con capacidad inhibidora de proteasas de relevancia biomédica.

Tabla modificada de Overall, C. M. & Blobel, C. P. (2007) y Turk, B. (2006)

La quimiogenómica permite además visualizar procesos in situ e in vivo^19,20 gracias a la monitorización o seguimiento de proteasas, normalmente mediante marcadores fluorescentes, que están unidos a una molécula de sustrato especialmente diseñada para diferenciar las formas activa de enzimas de las inactivas. Estos marcadores proporcionan imágenes de la actividad y localización del enzima de interés en procesos tanto normales como patológicos²¹. Esta técnica se puede utilizar para el diagnóstico y no requiere de un equipamiento muy sofisticado, por lo que su empleo puede ser rutinario, permitiendo disminuir los altos costes requeridos por otras técnicas de obtención de imágenes^22,23. En concreto, en el consorcio europeo sobre quimiogenómica que coordina el Profesor Francesc Xavier Aviles de la Universitat Autònoma de Barcelona se desarrollan péptidos marcados con moléculas fluorescentes que sólo emiten una señal fluorescente si son modificados por la proteasa contra la cual han sido diseñados. De esta forma, no se detecta la fluorescencia en ausencia de la actividad proteasa que estamos estudiando, pero cuando la proteasa reconoce e hidroliza al sustrato se observa un aumento de la fluorescencia, que permite medir su actividad y visualizar su localización celular y/o tisular simultáneamente (Figura 2). El proyecto CAMP “Chemical Genomics by Activity Monitoring of Proteases” está financiado por el 6º Programa Marco de la Unión Europea y sus objetivos generales son:

i) desarrollo de marcadores moleculares contra proteasas de interés biomédico que monitoricen su actividad y localización celular in situ e in vivo,

ii) visualización a nivel atómico de las interacciones entre análogos de sustratos e inhibidores con las proteasas de interés mediante cristalografía de rayos X.

iii) integración de la información obtenida a partir de la estructura tridimensional con los resultados obtenidos in vivo, para desarrollar mediante técnicas in silico, fármacos más específicos y con menos efectos secundarios.

Esperamos que este proyecto sea, al llegar a su finalización (Junio 2009), un hito importante en la quimiogenómica europea por haber desarrollado: compuestos que proporcionen imágenes de la actividad de las proteasas in situ e in vivo; inhibidores específicos que bloqueen rutas metabólicas mal reguladas por proteasas, y estructuras tridimensionales de nuevas proteasas con sus inhibidores y/o análogos de sustrato (Figura 3).

IV. Algunas Aportaciones de la Quimiogenómica a la Medicina.

Se han generado grandes expectativas sobre las potenciales aplicaciones directas de la Quimiogenómica al diagnóstico y tratamiento médicos. Algunas de ellas ya las hemos mencionado anteriormente, como la reducción y abaratamiento substancial del largo y costoso proceso de descarte inicial de moléculas que se están investigando para dar lugar a fármacos o a sus precursores. Hay que citar también la obtención de fármacos con menores efectos secundarios inesperados. Ambos son campos de enorme impacto e interés farmacológico y médico.

Otro de dichos intereses radica en la importante y creciente área del diagnóstico médico mediante la utilización de técnicas de imagen. Es bien sabido que las técnicas actuales para el diagnóstico médico precoz mediante visualización de imágenes son caras, requieren personal muy cualificado, y precisan de una infraestructura adecuada y de un mantenimiento y reparación continuo que elevan su coste. El alto gasto económico junto con la necesidad de instalaciones exclusivamente dedicadas a alojar el equipamiento en grandes hospitales o centros privados reduce o impide su uso en muchos países subdesarrollados y en ciertos sectores desfavorecidos de la sociedad occidental. Según IMV Medical Information División, una empresa estadounidense que analiza el mercado de la instrumentación biomédica, en Estados Unidos se realiza cada año 70 millones de “escaners” aproximadamente por resonancia magnética y tomografía axial computerizada, lo cual resulta en un coste aproximado de 9.300 millones de euros anuales; cifras similares se pueden trasladar a Europa.

Estos altos costes impiden su amplio uso en regiones menos desarrolladas del planeta y, por tanto, urge el desarrollo de alternativas innovadoras y económicas que siendo igual de efectivas, reduzcan la factura clínica en la detección precoz de muchas enfermedades, a pesar de que redunde ligeramente en la calidad de la imagen.

La quimógenómica diseña marcadores moleculares que proporcionan una imagen en la diana molecular de interés. Esta imagen se genera normalmente por fluorescencia, por lo que es muy sensible, y su bajo coste la hace una técnica ideal para su uso rutinario. Es más, la obtención de esos marcadores moleculares sienta la base para el diseño inteligente de inhibidores específicos.

V. Perspectivas

En el siglo XXI, ninguna rama de la ciencia puede trabajar independientemente de las demás,; la investigación translacional permite la sinergia de muchas disciplinas que ya se encuentran muy desarrolladas pero que podrían hallarse huérfanas de aplicaciones directas para su uso general. Hacia este camino tiende la quimiogenómica que, junto con otras metodologías nuevas como la biología de sistemas, aspira a dar una visión global de las moléculas y macromoléculas de las que estamos constituidos, y de cómo éstas se integran en sistemas biológicos, con el objetivo de intentar llegar a posibilitar una atención personalizada para cada paciente en un futuro no muy lejano a partir de su información genética.

Pero hasta que no llegue ese día, ¿qué podemos hacer desde las Universidades y centros de investigación de Europa? En primer lugar, seguir la estela y evitar que aumente la ventaja que nos llevan nuestros colegas norteamericanos. El Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI) coordina una acción para garantizar a los investigadores el acceso a quimiotecas, con el objeto de usar los compuestos químicos como marcadores en el estudio rutas celulares. Se espera que la información obtenida sirva para el desarrollo inicial de nuevos fármacos que a continuación, podrán ser desarrollados por la industria farmacéutica hasta sus estados finales previos a la comercialización. No cabe duda de que este espíritu emprendedor y de colaboración entre los diferentes sectores gubernamentales, académicos e industriales es uno de los factores que hacen posible que una sociedad progrese, y es asimismo el camino más seguro para que Europa sea uno de los pilares mundiales de la investigación básica y clínica.

Links interesantes

http://merops.sanger.ac.uk/

http://www.ncgc.nih.gov/

http://www.cgc.mpg.de/

http://www.uniovi.es/degradome/index.htm

http://www-db.embl.de/jss/servlet/de.embl.bk.emblGroups.EmblGroupsOrg/g_248

Figura 1.

La quimiogenómica se dedica a la búsqueda de nuevas moléculas para la monitorización, visualización y modulación de los productos génicos en los procesos biológicos.

Los genes y sus productos (parte superior y media del esquema) son la base sobre los que se desarrollan y buscan nuevas moléculas. La optimización de estas nuevas moléculas (parte inferior del esquema) lleva a la producción de marcadores y fármacos que monitorizan y regulan procesos de interés biomédico y biotecnológico.

Figura 2.

Ejemplo de marcadores obtenidos mediante quimiogenómica para la visualización “imaging” de las proteasas in vitro e in vivo. La estrategia empleada estriba en la detección de una señal, la fluorescencia por ejemplo, sólo si el marcador reacciona con una proteasa activa. En caso de que la proteasa no esté activa, o no se encuentre en la muestra que se estudia, no se detecta la señal. Un ejemplo de esta estrategia son los marcadores que llevan incorporados dos moléculas fluorescentes en el mismo marcador. El marcador diseñado no emite fluorescencia debido a la poca distancia intramolecular entre ellas (“quenching” de la fluorescencia) pero, si una proteasa reconoce el compuesto y lo hidroliza, las moléculas fluorescentes se separan y se emite fluorescencia, permitiendo simultáneamente, la monitorización de la actividad de la proteasa y su localización.

Figura 3.

Esquema generalizado de un proyecto de quimiogenómica. El esquema muestra cómo partiendo del genoma y del proteoma de proteasas, se utiliza la estructura tridimensional de las proteínas, métodos de selección química y ensayos celulares de forma iterativa, para obtener marcadores específicos y funcionales del proteoma estudiado.

Algunas Referencias Bibliográficas

1. Dobson, C. M. Chemical space and biology. Nature 432, 824-8 (2004).

2. Schreiber, S. L. Small molecules: the missing link in the central dogma. Nat Chem Biol 1, 64-6 (2005).

3. Gagna, C. E. & Lambert, W. C. Novel drug discovery and molecular biological methods, via DNA, RNA and protein changes using structure-function transitions: Transitional structural chemogenomics, transitional structural chemoproteomics and novel multi-stranded nucleic acid microarray. Med Hypotheses 67, 1099-1114 (2006).

4. Bogyo, M. & Cravatt, B. F. Genomics and proteomics From genes to function: advances in applications of chemical and systems biology. Curr Opin Chem Biol 11, 1-3 (2007).

5. Mohamed, M. M. & Sloane, B. F. Cysteine cathepsins: multifunctional enzymes in cancer. Nat Rev Cancer 6, 764-75 (2006).

6. Harris, C. J. & Stevens, A. P. Chemogenomics: structuring the drug discovery process to gene families. Drug Discov Today 11, 880-8 (2006).

7. Mestres, J., Martin-Couce, L., Gregori-Puigjane, E., Cases, M. & Boyer, S. Ligand-based approach to in silico pharmacology: nuclear receptor profiling. J Chem Inf Model 46, 2725-36 (2006).

8. Lopez-Otin, C. & Overall, C. M. Protease degradomics: a new challenge for proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 509-19 (2002).

9. Aviles, F. X. & Vendrell, J. (ed. Creighton, T. E.) 456-459 (J. Wiley & Sons, 2001).

10. Sitja-Arnau, M. et al. Mechanism of action of potato carboxypeptidase inhibitor (PCI) as an EGF blocker. Cancer Lett 226, 169-84 (2005).

11. Turk, B., Turk, D. & Salvesen, G. S. Regulating cysteine protease activity: essential role of protease inhibitors as guardians and regulators. Curr Pharm Des 8, 1623-37 (2002).

12. Turk, B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nat Rev Drug Discov 5, 785-99 (2006).

13. Venter, J. C. et al. The sequence of the human genome. Science 291, 1304-51 (2001).

14. Southan, C. A genomic perspective on human proteases. FEBS Lett 498, 214-8 (2001).

15. Barret, A. & Rawlings, N. D. (http://merops.sanger.ac.uk)

16. Mitsopoulos, G., Walsh, D. P. & Chang, Y. T. Tagged library approach to chemical genomics and proteomics. Curr Opin Chem Biol 8, 26-32 (2004).

17. Schmidinger, H., Hermetter, A. & Birner-Gruenberger, R. Activity-based proteomics: enzymatic activity profiling in complex proteomes. Amino Acids 30, 333-50 (2006).

18. Tripathi, R. P., Mishra, R. C., Dwivedi, N., Tewari, N. & Verma, S. S. Current status of malaria control. Curr Med Chem 12, 2643-59 (2005).

19. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K. & Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging 2, 159-75 (2003).

20. Jedeszko, C. & Sloane, B. F. Cysteine cathepsins in human cancer. Biol Chem 385, 1017-27 (2004).

21. Baruch, A., Jeffery, D. A. & Bogyo, M. Enzyme activity--it's all about image. Trends Cell Biol 14, 29-35 (2004).

22. Greenbaum, D. et al. Chemical approaches for functionally probing the proteome. Mol Cell Proteomics 1, 60-8 (2002).

23. Greenbaum, D. C. et al. Small molecule affnity fingerprinting: a tool for enzyme family subclassification, target identification, and inhibitor design. Chem Biol 9, 1085-1094 (2002).