Genómica aplicada

Genómica del cáncer

Javier Benítez
Centro Nacional Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid

El cáncer es una de las enfermedades más comunes y severas de nuestra sociedad. Alrededor de un tercio de la población desarrollará, a lo largo de su vida, algún tipo de cáncer que será responsable de un 20% de las muertes en países desarrollados, y que supone más de un 10% del coste médico total.
El origen del cáncer hay que buscarlo por un lado en la susceptibilidad genética constitucional que va a tener cada individuo para desarrollar un tumor y por otro en los agentes exógenos que van a favorecer en determinados casos su desarrollo. Esta interacción va a dar lugar a cambios genéticos en las células del órgano diana que se van a ir acumulando en el transcurso del tiempo hasta que el proceso se hace visible clínicamente. Actualmente conocemos un buen número de genes responsables del desarrollo tumoral que están agrupados en diferentes familias como son los oncogenes, los genes supresores, genes relacionados con distintos procesos: reparación del DNA, apoptosis celular, angiogénesis, metástasis, senescencia etc. En conjunto se han identificado más de 200 genes implicados directamente en el proceso tumoral pero un número mucho mayor que pueden actuar indirectamente. El conocimiento de alguno de ellos y de la función de sus proteínas ha permitido iniciar tratamientos específicos basados en esas funciones. Por ejemplo, el tamoxifeno es el tratamiento de elección en el cáncer de mama con receptores positivos de estrógenos, mientras que el fármaco Herceptin ha sido aprobado para su utilización en el cáncer de mama con sobreexpresión del oncogén ERBB2 (receptor del factor de crecimiento) al actuar bloqueando dicho receptor.

Sin embargo, sabemos que el cáncer es un proceso lento y que van a transcurrir varios años desde que se origina la primera mutación hasta que se detecta el tumor o se tienen las primeras manifestaciones clínicas, y durante ese periodo diferentes genes se van a ver alterados. La identificación de estos genes en los diferentes estadíos preneoplásicos y neoplásico constituye uno de los mayores retos científicos que se está abordando con las nuevas aproximaciones tecnológicas basadas en los arrays, chips o matrices de DNA, RNA o proteínas.

Las nuevas tecnologías

El desarrollo tecnológico al que hemos asistido en la última década ha permitido el estudio masivo de genes generando una información nueva que ha facilitado en paralelo el desarrollo de herramientas bioinformáticas para su análisis. La posibilidad de estudiar nuestro genoma en su totalidad, utilizando las nuevas tecnologías, ha dado lugar a una nueva era en la biomedicina, basada en la genómica, cuyas repercusiones y aplicaciones están empezando a ser visibles en nuestra sociedad. La definición de la genómica incluiría la identificación y el estudio de genes, de sus funciones e interacciones, con el objetivo de llegar a conocer y explicar el fenotipo de un cáncer (1). Puesto que la genómica pretende llegar a conocer la estructura y la función de los genomas, se ha dividido clásicamente en genómica funcional, cuya diana sería el resultado del proceso de la expresión génica: el RNA, las proteínas y los metabolitos, es decir moléculas que se van a encontrar sobreexpresadas o reprimidas en un tejido específico y en una situación concreta, y en genómica estructural que va a centrarse en el conocimiento físico del genoma y cuya diana principal va a ser el DNA (2).

Genómica funcional:

Los arrays , o micro matrices, de expresión surgieron inicialmente para analizar la diferente expresión de cientos o miles de genes a la vez en diferentes tejidos o en muestras tumorales. El objetivo es ir definiendo un patrón de expresión génica del tumor que nos de respuesta acerca de sus características moleculares, y asociarlas a las características clínicas del mismo, de su pronóstico y supervivencia (Fig.1).

Fig.1. Los arrays son elementos en los que se imprime el cDNA de los genes o de parte de ellos en número de cientos, miles o de todo el genoma. Sobre ese porta se hibrida el RNA de la muestra objeto de estudio y una muestra control, cada una de ellas marcada con un fluorocromo de diferente color (Cy3 y Cy5), y tras la hibridación se escanea y se observan las diferencias, según el nivel de color, en cada gen. Las diferencias en la coloración nos indicarán si algún gen de la muestra objeto de estudio se encuentra sobreexpresado o reprimido siendo en esos casos, candidatos a estudios en mayor profundidad (1A).
Estos resultados tienen que ser convertidos en datos numéricos para su interpretación y para ello , la bioinformática ha desarrollado en estos años un gran número de herramientas que nos permiten contestar a las preguntas que son objeto de nuestro interés agrupando los datos de la manera que se desee, mediante agregaciones jerárquicas que pretenden simplificar al máximo el número de datos a analizar (1B).

A partir del año 2000 empezaron a aparecer los primeros trabajos en este campo y entre sus múltiples aplicaciones habría que destacar la clasificación molecular que se ha ido estableciendo en muchos tumores en base a su perfil molecular. Los linfomas difusos fueron el primer ejemplo objeto de publicación y los primeros en ser clasificados a nivel molecular en dos subtipos, en base a una firma genética de solo 18 genes. Estos grupos se diferenciaban además en la supervivencia presentando curvas muy diferentes entre sí.

Desde entonces se han estudiado un gran número de tumores. En el caso del cáncer de mama, la nueva clasificación molecular que se ha definido, se está aplicando ya en la clínica y ha generado el primer kit pronóstico surgido de esta tecnología. En el año 2001, se hizo un amplio estudio de expresión en tumores de mama y se clasificaron en 5 subgrupos: Basal, HER2, Luminal A, Luminal B y Normal Breast Like, cada subgrupo presenta unos marcadores propios que permiten su identificación, con un pronóstico asociado, y con posibles tratamientos específicos (3). Así, el subtipo Basal que es el subtipo de peor pronóstico, representa alrededor de un 15% de los tumores de mama y es también el subtipo mayoritario entre los tumores hereditarios con mutación en BRCA1. Dadas sus características podría ser un tumor candidato a un tratamiento dirigido con inhibidores del EGFR (receptor del factor de crecimiento endotelial), que es uno de los genes que se encuentran sobreexpresado en estos tumores. Todo ello está permitiendo en algunos centros empezar a definir, desde el diagnóstico, no solo el pronóstico del tumor sino posibles tratamientos alternativos en subgrupos específicos.

Un segundo paso ha sido valorar e identificar firmas genéticas que pudieran asociarse a metástasis o recidívas, y en este sentido el grupo de Laura Van’t Veer ha conseguido seleccionar un conjunto de 70 genes que predicen la recidiva a los 5 años en mujeres con cáncer de mama , en cuyo diagnóstico no se detecta afectación ganglionar (4). La identificación de este conjunto de genes pronóstico, es importante de cara al tratamiento y seguimiento ya que este kit (Mammaprint) permite seleccionar, de modo selectivo, al 30% de las mujeres que van a presentar una futura recidiva, evitándole al 70% restante la terapia tan agresiva que está asociada al cáncer de mama. Este kit se está utilizando ya en muchos centros españoles y constituye el primer ejemplo de “oncología traslacional” basado en la genómica.

Genómica estructural

a) Genotipación del genoma

El proyecto Genoma Humano puso de manifiesto en el 2002 que los seres humanos compartimos el 99.99% del genoma mientras que el 0.01% restante son polimorfismos de una única base que se conocen con el nombre de SNPs. (single nucleotide polymorphisms) y que se encuentran por millones en nuestro genoma siendo la causa de la diversidad poblacional entre los seres humanos, de la mayor o menor susceptibilidad al desarrollo de enfermedades, o de la respuesta a fármacos. El conocimiento de los SNPs supuso el inicio de una nueva etapa en el campo de la genómica, ya que ha permitido empezar a abordar las enfermedades multifactoriales o complejas en las que se trata de identificar el conjunto de genes de susceptibilidad constitucional, conocidos como genes de baja penetrancia (LPG). Estos genes a nivel individual confieren un riesgo muy pequeño, pero en conjunto, cuando se encuentran varios de ellos en una persona pueden dar un riesgo tan alto como el de los genes de alta penetrancia (5).

La identificación de los LPG se realiza mediante los estudios de asociación entre casos y controles. Se selecciona el gen o los genes de interés para el tumor objeto de estudio y una vez seleccionados se busca en las bases de datos aquellos SNPs que puedan ser de interés, especialmente aquellos que están en zona con capacidad de codificación ya que el cambio de base puede generar un amino ácido distinto. Si al comparar la frecuencia de los SNPs en ambas poblaciones, ésta es mayor en casos y es estadísticamente significativa, entonces se dice que ese alelo confiere un riesgo relativo (OR) que suele ser inferior a 1.5 (Fig.2). Esto quiere decir que si una mujer tiene una probabilidad del 10% de desarrollar un cáncer de mama a lo largo de su vida, si presenta este SNP de riesgo su probabilidad será del 15% (10x1.5). Si esa mujer presenta varios SNPs de riesgo, su probabilidad irá incrementando.

Fig.2. Para los estudios de asociación hay que seleccionar los genes de interés, generalmente ubicados en vías biológicas relacionadas con el tumor objeto de estudio, por ejemplo la vía de reparación del DNA, y los SNPs que se encuentran en esos genes, principalmente en exones, región 3’UTR (por ser sitios de unión a miRNA) y regiones 5’UTR por ser sitios de unión a factores de transcripción). Después se analizan en un grupo de casos y controles y se evalúa si los SNPs se encuentran mas frecuentemente en uno u otro grupo para establecer el riesgo relativo (OR) que confieren.

Los últimos años nos han traído cambios en cuanto a la forma de hacer estos estudios, por un lado tecnológicos, con el desarrollo de la tecnología de “high throughput” o de análisis masivo, que permite el estudio de cientos, miles, o cientos de miles de SNPs al mismo tiempo. Por otro lado conceptual, ya que hoy día sabemos que para identificar pequeños riesgos es necesario un tamaño poblacional muy grande, cuanto mayor es el tamaño poblacional, menor es la probabilidad de un falso positivo. Con este punto de partida nacieron en los últimos 4 años los Consorcios Internacionales que aportan un elevado número de casos y controles para este tipo de estudios.
Gracias a esta evolución se han empezado a identificar los LPG responsables de las enfermedades complejas entre las que se encuentra el cáncer. Actualmente hay alrededor de 40 genes de susceptibilidad al cáncer ya identificados, cada uno de ellos confiriendo un riesgo no superior a 1.3, un riesgo menor de lo esperado y que sugiere la existencia de cientos de genes de susceptibilidad que deben interaccionar entre sí para facilitar el desarrollo tumoral (Tabla).

El cáncer de mama es un buen ejemplo del éxito de esta nueva estrategia. El primer estudio se publicó en el año 2007 y fue realizado por el consorcio BCAC (Breast Cancer Asociation Consortiun) que agrupa a 21 grupos europeos (6). El estudio se realizó estudiando mas de 30.000 casos y otros tantos controles. A lo largo de tres etapas se fueron filtrando los 250.000 SNPs distribuidos a lo largo del genoma hasta finalmente seleccionar 8 SNPs candidatos que presentaban una P de 10-8 destacando uno de ellos, un SNP localizado en el gen FGFR2 (receptor de factor de crecimiento de fibroblastos) que tenía una P de 10-76. Estos SNPs han sido validados en otros tres estudios masivos indicando la robustez y fiabilidad de los análisis de todo el genoma aplicando la nueva estrategia (Tabla).

Genes de baja penetrancia identificados en cáncer a partir de estudios masivos de todo el genoma (GWA)

Enfermedad/rasgo	Región	Gen	P	OR por copia o por heterocigoto (95% CI)	Plataforma y SNP
Ca. Próstata	8q24.21	Intergénico	1 x 10-12 3 x 10-15	1.79 (4.53-2.11) 2.10 (1.75-2.53)	Illumina: 316,515
Ca. Próstata	8q32.21	Intergénico	9 x 10-13	1.26 (1.13-1.41)	Illumina: 538.548
Ca. Próstata	17q12 17q24.3	TCF2 Región pobre en genes	1 x 10-11 3 x 10-10	1.22 (1.15-1.30) 1.20 (1.14-1.27)	Illumina: 310,520
Ca. Mama	10q26.13 16q12.1 5q11.2 8q24.21 11p15.5	FGFR2 TNCR9/ LOC643714 MAP3K1 Intergénico LSP1	2 x 10-76 1 x 10-36 7 x10-20 5 x 10-12 3 x 10-9	1.26 (1.23-1.30) 1.20 (1.16-1.24) 1.13 (1.10-1.16) 1.08 (1.05-1.11) 1.07 (1.04-1.11)	Perlegen: 205,586
Ca. Mama	10q26.13	FGFR2	1 x 10-10	1.20 (1.07-1.42)	Illumina: 528,173
Ca. Mama	2q35 16q12.1	Intergénico Cerca de TNRC9	1 x 10-13 6 x 10-19	1.20 (1.14-1.26) 1.28 (1.21-1.35)	Illumina: 311,524
Ca. Colon	8q24.21	Intergénico	1 x 10-14	1.27 (1.16-1.39)	Illumina: 547,647
Ca. Colon	8q24.21	ORF DQ515897	3 x 10-11	1.17 (1.12-1.23)	Illumina y Affymetrix: 99,632
Ca. Colon Ca. Pulmón	18q21.1 15q25.1	SMAD7 CHRNA	1 x 10-12 1 x 10-17	1.16 (1.09-1.27) 1.32 (1.24-1.41)	Illumina: 547,647 Illumina 316,515

Esta misma filosofía es la que se está usando en la búsqueda de genes de susceptibilidad responsables de la respuesta a fármacos. Además de los clásicos genes metabolizadores de fármacos como son los genes de la familia de los citocromos (CYP), el estudio masivo de vías específicas de genes o de todo el genoma está identificando nuevos genes relacionados con la respuesta a fármacos, como son los genes de reparación del DNA. El objetivo de estos estudios es la búsqueda de una medicina mas individualizada que permita ajustar la dosis adecuada de un fármaco a un paciente en función de su constitución genética, evitando toxicidades y efectos secundarios indeseables (7). Esto ha llevado a potenciar en primer lugar el concepto de la farmacogenética (referida al conjunto de variantes heredadas de DNA que afectan el metabolismo y respuesta de los fármacos) y posteriormente desarrollarla hacia la farmacogenómica (que se refiere de forma más general al estudio de genes que determinan el comportamiento de un fármaco y su respuesta).

c) Secuenciación del genoma

La tecnología ha seguido evolucionando y hace dos años surgían nuevos métodos de secuenciación que permiten secuenciar todo el genoma e identificar el número y tipo de mutaciones que se pueden encontrar en un tumor primario. Ya han aparecido algunos trabajos en los que se muestra cómo distintos tumores comparten gran cantidad de genes mutados, mientras que otros son específicos y pueden llegar a constituir futuras dianas terapéuticas. También se ha encontrado que la tasa de mutación es muy variable de unos a otros, por ejemplo, la tasa mas alta de mutación se ha encontrado en el cáncer de pulmón, con 4.2 mutaciones/Mb, seguido por el cáncer gastrointestinal con 1.2 mutaciones/Mb., mientras que el cáncer de mama solo presentó 0.19/Mb (8).
Actualmente se encuentra en sus inicios el Proyecto del Genoma del Cáncer, un proyecto internacional que pretende descifrar las alteraciones genómicas de todos los tipos de cáncer. España participa en el análisis de los linfomas coordinado por el Hospital Clínico de Barcelona en colaboración con el CRG y con la participación del CNIO.

Conclusiones

El proyecto Genoma Humano ha supuesto nuevos conocimientos, nuevas tecnologías y un desarrollo extraordinario de la bioinformática. Todo ello ha dado lugar a un nuevo concepto, la genómica, cuyas aplicaciones se están empezando a trasladar al ámbito clínico. Posiblemente el cáncer sea uno de los grandes beneficiarios a nivel diagnóstico, pronóstico y de tratamiento y en los próximos años se va a ir recogiendo parte de lo abonado en esta década y el flujo desde lo básico a lo aplicado se va a multiplicar. También se va a descifrar buena parte del perfil genético constitucional de susceptibilidad al cáncer con las técnicas de genotipación masiva, y las nuevas técnicas de secuenciación nos van a mostrar la realidad del genoma del cáncer. Todo ello va a tener una importante repercusión tanto en el nivel de la prevención como del tratamiento..

Bibliografía:

1- Hocquette JF. Where are we in genomics?. J Phisiol Pharmacol 2005, 56, 37-70.
2- Liu ET. Functional genomics of cancer. Current Opinion Genet Dev 2008, 18, 251-256.
3- Sørlie T et al.Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(19): 10869-74.
4- Weigelt B et al.Gene expression profiles of primary breast tumors maintained in distant metastases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 ,100(26):15901-5.
5- Manoio et al. A Hap Map harvest of insights into the genetics of common disease. J Clin Invest 2008, 118, 1590-1605.
6- Easton et al. Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci. Nature, 2007, 447, 1087-1093.
7- Evans WE and Relling MV. Moving towards individualized medicine with pharmacogenomics. Nature 2004, 429, 464-468.
8- Greenman C et al. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes. Nature 2007, 446, 153-158.

Páginas web de interés.:
www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP. Página dedicada a anotación de SNPs, localización, gen, frecuencia, distribución geográfica.
http://www.hapmap.org/ Página dedicada al proyecto Hapmap, sobre la variabilidad humana
http://www.pharmgkb.org/ Página dedicada a la actualización de los avances en el campo de la farmacogenética y farmacogenómica,
www.genome.gov/ENCODE Página dedicada a los avances en la identificación y localización de genes que codifican para proteínas y para no proteínas.
http://cgap.nci.nih.gov/ Página dedicada a describir el Proyecto del Genoma del Cáncer.



Actualidad en Instituto Roche	Nuevo Meeting Review	Biomarcadores personalizados para monitorizar el cáncer	Secuenciados los genomas completos de cinco sudafricanos