Las enfermedades producidas por parásitos han mostrado ser resistentes a los éxitos de la medicina preventiva de la segunda mitad del siglo XX. La falta de conocimientos sobre los genomas de los parásitos y su expresión, o lo que es lo mismo, sobre las características moleculares en las que se basa el comportamiento de los mismos, hizo que los sistemas de lucha frente a la infección que habían resultado útiles en el caso de las enfermedades originadas por gran parte de los virus y bacterias fracasaran estrepitosamente en el de aquellas producidas por parásitos intracelulares. La malaria, la leishmaniosis, las diarreas y las enfermedades respiratorias transmisibles*, resultan todavía un reto médico y biológico de primera magnitud en este comienzo de siglo. Los esfuerzos realizados en la secuenciación de los genomas (genómica) de estos agentes infecciosos han producido una gran cantidad de información que ya está teniendo un gran impacto en nuestro conocimiento sobre la fisiología de los parásitos. No obstante, la secuencia de los genomas ha proporcionado tal cantidad de datos que su análisis por las técnicas clásicas reduccionistas de biología molecular resulta demasiado compleja, sobre todo en el análisis conjunto de los resultados. En la actualidad hay que utilizar las llamadas técnicas de genómica funcional que incluye la bioinformática, el mapeo de genes, las modificaciones del genoma y el análisis de la transcripción para poder llegar a conclusiones útiles en el desarrollo de nuevos fármacos o vacunas. Los microarrays (micromatrices) aparecen como una técnica excelente para conocer la funcionalidad de los genes conocidos de los parásitos porque permiten determinar simultáneamente la expresión (esto es, el estado funcional: silente, normal o activo) de miles de genes procedentes de un genoma. En esencia, un microarray es una disposición ordenada de fragmentos de genes formando una matriz sobre un soporte. Estas disposiciones de fragmentos de genes se corresponden generalmente con los clones de una genoteca completa en los arrays genómicos o con oligonucleótidos que se corresponden con los genes obtenidos de una secuenciación de un genoma de un parásito. Existen otros tipos de arrays en los que las muestras ordenadas son proteínas o azúcares, pero son mucho menos utilizados en estos momentos y no los vamos a tratar aquí.

Para mostrar el uso de los microarrays en el estudio de los parásitos utilizaremos el ejémplo de un protozoo, Leishmania infantum, responsable de la leishmaniosis visceral en el viejo mundo, esencialmente en el sur de Europa y el norte de África. Esta enferemdad afecta a quince millones de personas con cincuenta mil fallecimientos al año.

El caso de Leishmania infantum

El estudio de los perfiles de expresión génica en los procesos de diferenciación de L. infantum para la selección de genes ligados a la infectividad del protozoo, se ha llevado a cabo mediante la construcción de unos microarrays de ADN a partir de una genoteca completa de L. infantum obtenida por fragmentación al azar en la que se contemplan los aproximadamente 8.300 genes que tiene este parásito. El resto de microarrays existentes de diferentes especies de Leishmania son parciales y/o de oligonucleótidos en los que se contemplan solo los genes predichos en el proyecto genoma de L. infantum. Gracias a que se dispone de los microarrays obtenidos a partir de la genoteca completa, se ha detectado que no han sido localizados aún todos los genes del parásito en la secuencia del proyecto genoma. Estos microarrays permiten realizar el análisis simultáneo de treinta mil genes (o fragmentos de genes) a la vez en cada experimento. De una forma complementaria y al mismo tiempo que se realizan este tipo de estudios también se puede plantear el estudio de los mecanismos de protección desarrollados por el hospedador mamífero frente al protozoo parásito para lo que se determinan los perfiles de expresión génica en las células del huésped en uno de los principales órganos diana del parásito, el ganglio linfático, lugar preferente para la presentación de antígeno en animales enfermos y en aquellos que han superado la infección. Para este último estudio se pueden utilizan microarrays contruidos con oligonucleótidos de perro de los que se puede disponer comercialmente. El objetivo siempre es el mismo: detectar que genes puedan ser responsables por una parte del incremento de la capacidad infectiva del parásito, y por otra, de las “contramedidas” puestas en marcha por el hospedador infectado para defenderse de la invasión. El conocimiento de estos genes puede resultar en el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos especificamente a una “diana” detectada o al conocimiento de una molécula útil para el desarrollo de una vacuna preventiva.

El caso de L.infantum permite ver de una forma sencilla la utilidad de estas técnicas en el estudio de las diferentes fases del parásito que coinciden con la capacidad de infectar del mismo. Su ciclo biológico pasa por dos fases muy distintas ((Figura 1). En una, móvil, dentro del intestino del mosquito vector, el parásito, llamado promastigote va avanzando a lo largo del tubo digestivo hacia la probóscide mientras se capacita para la infección de tal forma que las primeras fases no tienen capacidad infectiva que adquiere justo cuando se encuentra listo para ser innoculado en el mamífero huésped. Un vez dentro de éste y superando el ataque inicial del sistema inmune, se introduce en las células fagocíticas y allí, protegido de los sistemas defensivos del plasma sanguíneo (sitema del complemento) se convierte en una forma inmóvil o amastigote que puede sobrevivir y multiplicarse infectando nuevas células del sistema, ser confinado o eliminado, dependiendo de las características del parásito y de la respuesta inmune protectora del huésped. Así, es necesario conocer las diferencias existentes entre dos situaciones distintas del mismo protozoo para determinar cuales son los mecanismos no solo de ataque sino también de bloqueo de los sistemas defensivos del huésped. Detectar cuales son los genes que están activados en cada momento parece un buen método de estudio de estos factores responsables de la capacidad de infección.

Fig 1. Ciclo biológico de Leishmania (Figura adaptada de Sacks y Noben-Trauth, 2002).

En un estudio de expresión génica diferencial se sigue el siguiente protocolo (Fig. 2). Se basa fundamentalmente en la cuantificación relativa de los ARN transcritos mediante la comparación de los ARN mensajeros aislados de las dos muestras biológicas a comparar. Es decir, se mide la cantidad de ácido nucleico de una célula que va a transformarse en una proteína con una función determinada o lo que se conoce en terminos científicos como “expresión” de una información genética en un momento determinado. En primer lugar, se realiza la extracción del ARN total de las dos muestras que se quieren comparar, se comprueba la calidad en un bioanalizador y se lleva a cabo la amplificación del ARN mensajero, ya que normalmente la concentración que se obtiene es demasiado baja para realizar la posterior hibridación (reacción específica) con los microarrays. Seguidamente se realiza la síntesis de los correspondientes ADN complementarios (ADNc) incorporando dos moléculas fluorescentes para su detección, fundamentalmente para este tipo de ensayos se utilizan las cianinas Cy3 (verde) y Cy5 (rojo), según corresponda para cada comparación de la trancripción. Estos fluoróforos cumplen una serie de condiciones que los convierten en útiles para la comparación de las muestras: son fotoestables, tienen una elevada intensidad de fluorescencia, presentan un espectro de fluorescencia bien separado y son, por tanto, resistentes al fotobleaching o apantallamiento. Se realiza una hibridación conjunta de las dos poblaciones de ADNc (una marcada con Cy3 y la otra con Cy5) con los microarrays de ADN, utilizando varias réplicas para cada experimento para minimizar las variaciones experimentales. Se analizan las intensidades de fluorescencia con un escáner y se recogen los datos en un software adecuado obteniéndose un código de colores. En la imagen combinada de colores el color rojo indicaría que la cantidad de ADNc de una de las muestras que ha hibridado en ese punto es mayor que la de la muestra a comparar, el color verde indicaría lo contrario y el color amarillo indica que no hay cambios, es decir que los genes en ese punto están regulados de igual forma.

Fig. 2. Esquema del análisis de la expresión génica diferencial mediante microarrays de ADN.

Por último se realiza una normalización de los datos de intensidad de fluorescencia y las desviaciones típicas y se aplica un contraste de hipótesis con un test estadístico como la t de Student (ver fig3). Los requisitos que se utilizan normalmente para la selección de spots (puntos) son: los valores de cociente de intensidades de fluorescencia (Cy5/Cy3 si Cy5 > Cy3; -Cy3/Cy5 si Cy5 < Cy3) deben ser F ≥ 1,7 o 2 (por convención); la intensidad de fluorescencia para uno de los fluoróforos debe ser al menos 10 veces superior al valor medio del background (4000 UF) y el valor de significación estadística p < 0.05. (Fig. 3).

Fig. 3. Scatter plot medio de las réplicas del análisis de hibridación por microarrays del perfil de expresión de los promastigotes procíclcos (Cy3, verde) y metacíclicos (Cy5, rojo). (A) Intensidad vs. intensidad de fluorescencia en escala logarítmica en base 2 (B) Scatter plot M/A. M= (log2 Ri-log2Gi) y A=[(log2Ri+log2Gi)/2], donde R y G son respectivamente la intensidad de fluorescencia de Cy5 y Cy3.

Cada punto seleccionado en la gráfica se corresponde con un punto del array y con un clon de la genoteca. Los insertos contenidos en los clones de la genoteca seleccionados en los análisis de expresión son secuenciados a continuación. Las secuencias obtenidas se comparan y ensamblan con las secuencias genómicas anotadas en el proyecto genoma del parásito para determinar qué genes están diferencialmente expresados.

Los resultados de expresión génica se deben confirmar con otra técnica como la PCR cuantitativa en tiempo real o la técnica de Northern blot. Además en algunos clones aparece más de un solapamiento con genes anotados, en estos casos, también es necesario realizar un análisis de expresión adicional para determinar que genes están diferencialmente expresados.

La interpretación del conjunto de datos de genes diferencialmente expresados se lleva a cabo mediante el análisis de términos de procesos biológicos y funciones moleculares de la base de datos Gene Ontology (GO), que constituyen una nomenclatura controlada. Este análisis funcional se realiza mediante el programa informático BLAST2GO, con el que se obtienen gráficos acíclicos directos (DAG), que relacionan los términos de funciones moleculares y procesos biológicos que se encuentran en el conjunto de genes analizado. Los datos obtenidos permiten determinar, sin lugar a dudas, las vías metabólicas modificadas en las fases infectivas del parásito frente a las no infectivas y los genes responsables de esa activación.

Esta metodología, ciertamente compleja, aunque ya rutinaria en los laboratorios especializados, se lleva a cabo para el estudio de los perfiles de expresión génica en los procesos de diferenciación de L. infantum, Plasmodium falcíparum o cualquier otro parásito unicelular, normalmente asociados con su capacidad de infectar a un huésped. En estos momentos, los microarrays ya suponen una potente herramienta en manos de los parasitólogos interesados en la interacción entre el huésped y el patógeno y en un futuro inmediato produciran datos que contribuirán decisivamente a desentrañar los procesos de infección y de resistencia frente a los patógenos. En los próximos años van a proporcionar una información muy valiosa, complementaria con los simples estudios de secuenciación genómica. Su uso, junto a la proteómica, la metabolómica y la genética molecular proporcionarán una visión integrada y sin precedentes de todo el proceso que será decisiva en la lucha frente a las infecciones del presente siglo que siguen provocando graves epidemias que afectan a cientos de millones de personas con millones de muertes al año.

*La tuberculosis, a pesar de estar producida por una bacteria tiene un comportamiento intracelular en su detección y almacenamiento por el huésped.

• Direcciones de interés en la web

geneDB
Stanford MicroArray database
Microarray gene expression