Cáncer de pulmón

Javier de Castro Carpeño

Responsable de la sección
Hospital Universitario La Paz. Madrid

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Determinación de mutaciones de EGFR


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Determinación de mutaciones de EGFR.

EGFR es uno de los cuatro miembros de la familia de receptores de membrana con actividad tirosina kinasa (TK) conocidos de forma global como ErbB. La activación de este receptor supone tanto un beneficio de proliferación como un importante freno a la apoptosis, al estimular rutas oncogénicas como MAPK y PI3K/Akt/PTEN/mTOR.

En 2004, se describió por primera vez la existencia de mutaciones activadoras de EGFR en CPCNP, situadas en los exones 18-21, en la región codificante para el dominio intracitoplasmático TK del receptor, que producían una activación permanente de la vía de señalización mediada por EGFR1,2,3. De hecho, aquellos tumores portadores de esta mutación parecían depender en su origen y evolución de esta vía oncogénica, por lo que fueron unos de los primeros tumores que se denominaron “adictos al oncogén” por esta dependencia. Como consecuencia de ello, la inhibición del crecimiento de estos tumores mediante agentes ITK de EGFR fue demostrada tanto a nivel experimental como en la práctica clínica4,5.  Posteriormente, la correlación entre la presencia de mutaciones de EGFR y la respuesta a Gefitinib y Erlotinib ha quedado patente en estudios retrospectivos, con respuestas superiores al 65% y medianas de supervivencia de 20 a 30 meses6,7.

Varios estudios prospectivos y aleatorizados en fase III que han comparado la quimioterapia de primera línea frente a ITK en pacientes con CPCNP avanzado que presentan mutación EGFR, han demostrado el beneficio de los inhibidores al obtener una mayor tasa de respuesta (hasta un 70%) y de la supervivencia libre de progresión (9-15 meses). Estos estudios se han realizado con dos ITK reversibles, Gefinitib8,9,10 y Erlotinib11,12i, y uno irrevesible, Afatinib13,14.  Por dicho motivo, estos tres inhibidores  Gefitinib (Iressa®, AstraZeneca, Macclesfield, Reino Unido), Erlotinib (Tarceva®, OSI/Genentech, Boulder, CO/South San Francisco, California, EE. UU.) y Afatinib (Giotrif®, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) tienen indicación en la actualidad para el tratamiento de pacientes con CPCNP que presentan mutaciones de EGFR.

Como se ha señalado previamente, las mutaciones activadoras de EGFR se localizan entre los exones 18 al 21 en la región codificante para el dominio TK del receptor. El 90% de estas mutaciones son pequeñas deleciones en el exón 19 (donde se localizan los codones 747-750), o mutaciones puntuales en el exón 21 (L858R). El resto son  inserciones “in-frame” en el exón 20 (del 5 al 8%) o mutaciones puntuales en los exones 18 y 20 (del 2 al 5%).

Por tanto, las mutaciones de EGFR que se describen con más frecuencia son:
  • en el exón 18 del EGFR: mutaciones E709 y G719.
  • en el exón 19: deleciones de 9-, 12-, 15- y 24-bp (codones 746-753); o inserciones poco comunes  de 15-bp y 18-bp (codones 746-753).
  • en el exón 20: inserciones (codones 763-764, codones 767-774), S768I, T790M.
  • en el exón 21: L858R, T854 y las mutaciones L861Q y L861R.
Las mutaciones del exón 19 (pequeñas deleciones) son las que presentan mayor sensibilidad a los ITK y hay mutaciones que ofrecen una resistencia de novo o adquirida a los mismos como las T790M, G719A y L861Q.

Actualmente, diferentes guías clínicas y recomendaciones de expertos aconsejan identificar todas aquellas mutaciones individuales de EGFR que tienen una frecuencia de un 1% o superior15.

Como se ha demostrado en los estudios previos con los inhibidores de EGFR de primera o segunda generación, al cabo de un periodo que tiene como mediana 10-15 meses, los pacientes van a presentar progresión de su enfermedad. Esto es debido a la adquisición neoplásica de mecanismos de resistencia que fundamentalmente pueden ser: adquisición de una mutación de resistencia, activación de nuevas vías de señalización, transformación en carcinoma de células pequeñas pero, hasta en un 30% de casos, las causas de la progresión son desconocidas.

La aparición de una nueva mutación de resistencia es el mecanismo más frecuente ya que se puede encontrar hasta en cerca de un 60% de pacientes. En la mayoría de casos, se trata de la mutación T790M, una sustitución de treonina por metionina en el exón 20. La aparición de esta mutación provoca un cambio en la región de acoplamiento del receptor al ATP, favoreciendo su unión al tiempo que reduce la inhibición competitiva por el ATP de los inhibidores EGFR reversibles convencionales16,17.

Con el fin de vencer la resistencia establecida por la mutación T790M se han probado inhibidores de EGFR irreversibles y de tercera generación. Afatinib demostró una modesta eficacia con solo un 10% de respuestas y una supervivencia libre de 4 meses.18

También, se demostró que la combinación de Afatinib con Cetuximab alcanzaba una tasa de respuesta del 30% en pacientes que habían progresado a inhibidores de primera generación y cuyos tumores fueran portadores de la mutación T790M, pero esta asociación mostró una alta toxicidad cutánea y digestiva19.

Merece mención especial, la combinación de un agente anti-EGFR con un antiangiogénico. En un estudio fase II aleatorizado la adición de Bevacizumab a Erlotinib alcanzó una mediana de supervivencia libre de progresión muy significativa, 16 meses, frente a los 9 conseguidos por Erlotinib en monoterapia20.

En esta misma línea, el estudio BELIEF ha demostrado el beneficio de esta combinación de Erlotinib y Bevacizumab en tumores con presencia de mutación T790M, 16 meses, frente a los 10,5 meses de los casos que no tenían esa mutación. Por ello, varios estudios están confirmando la eficacia de esta asociación.

El gran avance ha venido de la mano de los denominados inhibidores de tercera generación como Osimertinib y Rociletinib que han demostrado actividad contra estos carcinomas portadores de la mutación T790M. Especialmente Osimertinib ha realizado el desarrollo clínico que ha confirmado su eficacia en esta población. Inicialmente un ensayo fase I/II en pacientes con CPCNP con mutación EGFR previamente tratados con inhibidores específicos, demostró un 60% de respuesta en población con mutación T790M y cerca de un 30% en casos sin mutación T790M21.

Estos resultados han llevado a la aprobación por la FDA de Osimertinib en pacientes con tumores que han progresado a inhibidores de primera o segunda generación y donde se detecta la presencia de la mutación T790M como causa de la progresión. Por el contrario, Rociletinib abandonó su desarrollo clínico recientemente debido a resultados no confirmados. Actualmente hay otros inhibidores en desarrollo como Olmutinib o ASP8273 con ensayos clínicos en marcha (NCT02500927, NCT02485652, y NCT02588261).

De igual modo, nuevas mutaciones de resistencia se han descrito ya para inhibidores de EGFR de tercera generación. En este sentido, estudios preclínicos han demostrado que la mutación de EGFR C797S confiere resistencia a esta tercera generación de agentes22. Otros mecanismos de resistencia que pueden desarrollarse pueden involucrar a factores de la transición epitelio-mesénquima, activación del eje mediado por las MAPK Kinasas o del IGF1R.

Cuando en pacientes con tumores portadores de mutaciones de EGFR se produce la progresión a los inhibidores convencionales y no se identifica la presencia de la mutación T790M, pueden estar involucrados otros mecanismos de resistencia como la activación de vías de señalización mediadas por otros oncogenes como amplificaciones en MET, HER2 y CRKL, sobreexpresión de AXL o mutaciones en KRAS o BRAF23.

La amplificación de MET se ha descrito en un 3-7% de pacientes y hasta en un 21% en enfermos previamente tratados con los agentes anti-EGFR de primera o de segunda generación24.

Tras varios agentes fallidos, nuevos fármacos como INC280 ha demostrado eficacia cuando se combina con agentes de primera generación en casos de progresión a los mismos por lo que su eficacia se está tratando de confirmar en ensayos clínicos (NCT01610336).

También se han descrito casos de transformación en un carcinoma de células pequeñas y no hay que olvidar que en cerca de un 30% de casos no se han identificado las causas de la progresión25.

Métodos de medición
El estudio de mutaciones de EGFR deberá ser realizado en laboratorios que tengan una técnica homologada y reproducible para este procedimiento.

Para todo tipo de estudios de tipo molecular (EGFR, ALK, otros) es necesario tener material tumoral suficiente. Por tanto, si consideramos la cantidad y calidad del tejido tumoral, la  muestra tumoral  más idónea  sería la procedente de una pieza quirúrgica, seguidas por las biopsias (bronquial, transbronquial, pleural o con aguja gruesa) y finalmente el bloque celular obtenido por citología26. También existe la posibilidad de realizar el estudio en suero27, aunque su sensibilidad dependerá de la cantidad de células tumorales circulantes que vendrá determinada, en gran medida, por el grado de afectación metastásica.

Con el fin de obtener la máxima rentabilidad, dado que el material disponible suele ser escaso y que cada vez se precisa realizar más estudios moleculares, se recomienda emplear una técnica de alta sensibilidad (<5%). En este sentido, la PCR en tiempo real (TaqMan PCR, Scorpions ARMS, Cobas) sería el procedimiento más adecuado y la secuenciación directa (Sanger, Pirosecuenciación) sólo debería realizarse si tenemos al menos un 50% de células tumorales28.

Por todo lo anteriormente expuesto, hay varias fases del proceso de determinación de mutaciones de EGFR y de otras alteraciones genéticas que son críticas.  En primer lugar, el material sobre el que se purificará el ADN tumoral debe ser evaluado por un patólogo experto que delimite la zona sobre la que se realizará la microdisección por láser, si está disponible, o la macrodisección sobre el portaobjetos donde está depositado el corte de la pieza original. Si existe material suficiente, se debe realizar una tinción con hematoxilina-eosina en los cortes situados en los extremos del material para extracción, asegurando así que existe una concentración similar en los cortes delimitados por ellos. En una segunda fase, debe garantizarse que la purificación del ADN es de suficiente calidad a través de los métodos estándares, evitando la secuenciación de smears o de ADN muy fragmentados, lo cual podría reducir la sensibilidad de la técnica. Además, es necesaria la presencia de controles internos de calidad, así como grupos controles que garanticen la existencia de la reacción.

En relación con la metodología de PCR que se debe emplear, es importante que se realice en centros con amplia experiencia en secuenciación automática o con experiencia en prestar servicio de secuenciación a centros externos. Además, sería necesario que la extracción del ADN sea automatizada. Por último, tanto la PCR para hibridación de la secuencia problema, como la necesaria para la secuenciación colorimétrica, deberían realizarse en el mismo centro, con lo que se evitarían manipulaciones adicionales del material.

No se recomienda el empleo estandarizado de técnicas ultrasensibles, con sensibilidad analítica menor del 1%, para la determinación de mutaciones ya que su interpretación puede ser complicada. Este punto es muy importante especialmente cuando la muestra tiene alta celularidad tumoral y hay discrepancias entre la positividad del método ultrasensible y la negatividad de los métodos convencionales.

Finalmente, en los informes de la determinación de la mutación de EGFR, y, en general, en todos los estudios moleculares, el informe debe recoger todos los aspectos previamente descritos: calidad de la muestra tumoral, método de detección realizado y sensibilidad del mismo, tipo de mutación encontrada y posible sensibilidad de la misma al tratamiento con ITK.

Se han desarrollado diversos anticuerpos monoclonales para la identificación de la mutación de EGFR por técnicas de inmunohistoquímica. Los resultados preliminares confirman un buen rendimiento de este procedimiento y sería una técnica más sencilla y por tanto accesible a un mayor número de centros para su detección29. Sin embargo, actualmente no se puede considerar un procedimiento estándar pero podría ser un buen método de cribado inicial en aquellos centros donde no se realiza la determinación de mutaciones de EGFR.

En los últimos años se está explorando la determinación de las mutaciones de EGFR en sangre. Este procedimiento permitiría poder realizar el test de mutaciones de EGFR cuando no es posible obtener material tumoral suficiente. Aunque todavía no es un proceso estandarizado los primeros estudios muestran una sensibilidad y especificidad cercana a los resultados obtenidos con la detección de las mutaciones en el tejido tumoral. Por otra parte, la detección de mutaciones de EGFR puede ser una herramienta útil. 

Recomendación
Dada la eficacia de los ITK en pacientes con CPCNP que presentan mutación EGFR, el análisis de mutaciones de EGFR se debería hacer en el mayor número posible de pacientes con CPCNP avanzado. Ya que el problema en cáncer de pulmón es la presencia de muestra tisular tumoral suficiente para la realización de la mutación, y aunque no hay un consenso totalmente establecido, se recomienda la realización del análisis de mutaciones de EGFR siempre en los pacientes en los que se presume una mayor probabilidad de encontrar dichas mutaciones, como son los enfermos que nunca han fumado o cuyos tumores tienen una histología de carcinoma no escamoso o el género femenino. En el resto de pacientes, la realización de la determinación de la mutación queda sujeta al criterio clínico.
 
 
 
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