Técnicas diagnósticas

Análisis de Heteroduplex (HA)

El Análisis de Heteroduplex se define como “El estudio de la movilidad de heteroduplex de DNA mediante electroforesis en geles de poliacrilamida”(1). Esta técnica para la detección de mutaciones se emplea normalmente conjuntamente con la técnica SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism analysis). Ambas técnicas están basadas en el mismo principio y pueden simultaneizarse en el mismo método.

Fundamentos del HA

Los heteroduplex se detectaron por primera vez como artefactos en reacciones de PCR donde había una deleción de dieciocho pares de bases(2): Al alcanzar los últimos pasos de una amplificación por PCR la polimerasa se convierte en un factor limitante, de modo que, durante los últimos periodos de annealing y síntesis, una porción del producto desnaturalizado rehibrida espontáneamente, sin extensión a partir de un cebador, y se forman de nuevo dímeros entre las cadenas complementarias del DNA amplificado.

Un Heteroduplex de DNA está formado por dos hebras de DNA complementarias, pero procedentes de alelos distintos. Cuando las hebras provienen ambas del mismo alelo se habla de homoduplex. Ahora bien, cuando los dos alelos de un gen difieren en parte de su secuencia, el heteroduplex que se puede obtener a partir de ellos incluirá posiciones no hibridadas al formarse que modificarán su conformación(3).

Esta deformación confiere al heteroduplex menor movilidad electroforética comparado con el homoduplex correspondiente de modo que presenta un patrón de migración alterado en geles nativos. Es este fenómeno el que se ha empleado como base de esta sencilla técnica para la detección de mutaciones. Su potencial para detectar cambios en la secuencia del DNA se estableció una vez que se lograron distinguir patrones de migración distintos para diferencias en un único par de bases(4). Normalmente son patrones de movilidad pequeños, pero pueden visualizarse tras electroforesis prolongada en geles nativos de poliacrilamida.



Aplicaciones del HA

Bajo condiciones ideales el Análisis de Heteroduplex combinado con SSCP tiene una eficacia cercana al 90%(5). En principio el criterio para elegir una técnica u otra (SSCP o HA) depende del tamaño del fragmento de DNA a estudiar: SSCP para fragmentos entre 150 y 300 pares de bases y HA para fragmentos de 250 a 400 pares de bases) entre sus múltiples aplicaciones puede emplearse como método de screening para búsqueda de mutaciones desconocidas, para la tipificación de marcadores polimórficos en estudios de seguimiento genético, caracterización de HLA para trasplantes de médula emparejando donante y receptor, detección de subpoblaciones celulares(4), para descartar mutaciones conocidas(6) o para detectarlas(7)...

Ventajas e inconvenientes del HA

Entre virtudes de esta técnica se cuentan su simplicidad, bajo coste, rapidez y eficacia. No precisa ningún equipamiento especialmente costoso o sofisticado, se parte de productos de PCR normales, sin necesidad de purificación y proporciona resultados fácilmente interpretables. A esto se añade la aplicación de técnicas de visualización alternativas al marcaje radioactivo, como son la tinción de plata, la de bromuro de etidio y el marcaje fluorescente.

Como inconvenientes se presentan la imposibilidad de averiguar la posición de la mutación y el nivel de eficacia conseguido con la prueba. Aunque si se trata de un screening de mutaciones conocidas, con protocolos optimizados pueden definirse patrones de migración reproducibles.

Futuro del heteroduplex

Ya se trata de una técnica “veterana”. Las perspectivas de desarrollo técnico del análisis de heteroduplex pasan por aumentar la cantidad de información que se pueda obtener de este tipo de análisis. Incluso se han desarrollado sistemas que incorporan las técnicas de cromatografía de alta resolución al Análisis de Heteroduplex, estudios con enzimas de restricción, Sourthern Blots... etc. Sin embargo el gran atractivo de esta técnica reside en su simplicidad, bajo coste y rapidez.