Técnicas diagnósticas

Técnica del SSCP

La técnica de SSCP o análisis de la conformación de polimorfismos de hebra sencilla, es un método utilizado habitualmente para la detección de mutaciones desconocidas. El grupo de Orita et al (45) lo describió a principios de los 90 y rápidamente el resto de la comunidad científica lo utilizó en sus investigaciones por su sencillez y rapidez de obtención de resultados. Es una técnica muy eficiente para detección de mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, reordenamientos, etc (46, 47). Además resulta especialmente sensible en la identificación de un único cambio de nucleótido en la secuencia del ADN o mutaciones puntuales.

El SSCP se basa en la diferencia de movilidad electroforética de ADN monocatenario cuando se separa en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. El ADN de hebra sencilla adopta una conformación o estructura secundaria que depende de la secuencia de nucleótidos. Cuando nos encontramos ante un cambio en un único nucleótido, la movilidad electroforética en gel es diferente comparada con su secuencia nativa. Por lo tanto podemos identificar mutaciones puntuales basadas en la diferencia de patrones electroforéticos. El primer paso es el diseño de primers adecuados para la amplificación de la secuencia diana mediante PCR y posteriormente se realiza la electroforesis en gel de acrilamida no desnaturalizante. Finalmente, se visualiza con métodos no radiactivos como bromuro de etidio(48), tinción de plata(49) o marcaje fluorescente(50). Cuando se encuentra un resultado positivo se debe analizar por secuenciación para puntualizar qué mutación es y dónde se encuentra. La movilidad electroforética depende de ciertos factores como la carga de la hebra monocatenaria, que permanece constante en moléculas de igual tamaño. Otro parámetro importante es la conformación que adopta el ADN en esas condiciones, altamente variable y dependiente de la secuencia.

La eficiencia y sensibilidad del SSCP depende de varios factores entre los que cabe destacar el tamaño del fragmento de ADN, la temperatura de la electroforesis, el entrecruzamiento de la acrilamida y algunos aditivos como el glicerol. Fragmentos demasiado pequeños son incapaces de formar estructuras secundarias, mientras que en aquellos de mayor tamaño una mutación puntual sería imposible de detectar a través del patrón electroforético. La máxima sensibilidad se obtiene en un rango entre 100 y 300 pb, siendo óptima en tamaños de 150-200 pb(51). Otro factor importante es la temperatura en la que se realiza la electroforesis. Existen numerosos protocolos publicados que recomiendan llevar a cabo el experimento bajo dos condiciones, a temperatura ambiente y a 4ºC (41). La movilidad depende de la temperatura y esto afecta a la reproducibilidad de los resultados.

Otros grupos publican un aumento de sensibilidad en la adición de ciertos aditivos. El glicerol (41, 49) en particular aumenta la resolución de las bandas en el gel de acrilamida, sin embargo los geles con glicerol retrasan el tiempo de la electroforesis. El búfer TBE puede ser incompatible con el glicerol y otros alcoholes por su composición de iones de borato, en tal caso se deben elegir otros búferes para realizar la electroforesis. Otro parámetro a tener en cuenta es la ratio acrilamida:bisacrilamida. Existen protocolos con ratios muy variables como 19:1(50), 29:1(51) y 49:1(52), mejorando las eficiencias ratios de 49:1. Una última variable en la que nos podemos fijar el porcentaje de los geles de acrilamida. Se obtienen mejores resultados con altos porcentajes(12-17%) pero este factor también depende del tamaño de la secuencia; tamaños pequeños se resuelven mejor en porcentajes elevados y tamaños grandes en menores porcentajes.

En teoría, se asocian dos bandas con la secuencia nativa donde una representa las hebras desnaturalizadas y la otra el ADN bicatenario. Si no tiene lugar una completa desnaturalización, pueden aparecer otras bandas correspondientes a diferentes conformaciones. Por este motivo, Condie et al sugirieron en su estudio cargar en el gel una muestra normal no desnaturalizada a la vez que el resto de muestras. La sensibilidad de detección de mutaciones alcanza hasta un 80% en carreras de fragmentos menores de 300pb(54), sin embargo otros grupos han publicado menores tasas de eficiencia(55). Como la sensibilidad no es del 100%, la ausencia de banda no predice ausencia de mutación, sino que en esas condiciones no existe un patrón alterado de electroforesis.

La gran ventaja del SSCP es la rapidez y la capacidad para analizar un elevado número de muestras en un periodo corto de tiempo. Además, cuando se analiza tumores primarios por otros métodos, es a menudo difícil detectar alelos mutantes por la contaminación de la muestra con células normales. Con el SSCP se puede lograr encontrar mutaciones puntuales en muestras donde la población normal alcanza entre 50-60%. Otra ventaja es la simplicidad de realización así como la sencillez del equipo utilizado tanto para realizar el experimento como para los geles. También es una técnica barata comparada con la secuenciación directa sin previo screening, sin embargo la gran desventaja es no poder detectar el 100% de mutaciones. Los experimentos se deben repetir bajo condiciones diferentes para aumentar la frecuencia de mutaciones y no se debe usar con fragmento mayores de 300pb (41).

La rapidez y sencillez le han llevado al SSCP a ser técnica de screening para la detección de mutaciones en mucho casos de tumores humanos. Se han publicado datos de análisis de mutaciones en p53 (55) en un gran grupo de tumores humanos, PTEN en tumores cerebrales (57), Kras en cánceres de pulmón (58), etc.