Técnicas diagnósticas

El DGGE como técnica de screening

La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) permite detectar mutaciones puntuales (8, 9) mediante la separación de fragmentos de DNA en un gel de poliacrilamida con una concentración creciente de un agente desnaturalizante, generalmente urea o formamida.

Esta técnica se basa en las propiedades de fusión del DNA de doble cadena. Una molécula de DNA se desnaturaliza en ciertas regiones denominadas dominios de fusión a una determinada temperatura (temperatura de fusión o Tm). La Tm se define como la temperatura a la que cada par de bases del DNA dúplex está en un equilibrio 50 a 50 entre el estado helicoidal y el desnaturalizado. Esta temperatura es dependiente de la secuencia de nucleótidos de la molécula de DNA ya que las interacciones entre bases adyacentes influyen en la estabilidad de la doble hélice. Cuando este fragmento se desplaza a través de un gel con un gradiente desnaturalizante alcanza un punto donde la concentración del agente desnaturalizante es igual a la Tm del dominio de menor temperatura de fusión, causando una desnaturalización parcial de la hebra y consecuentemente un retraso en su movilidad electroforética. Los fragmentos de DNA que difieren incluso en un único nucleótido en su dominio de fusión de menor Tm experimentan ramificaciones a diferente distancia a lo largo del gel (10).

La DGGE combinada con la PCR es extremadamente eficaz para detectar mutaciones puntuales en heterocigosis ya que la continua desnaturalización y emparejamiento de las cadenas de DNA durante los últimos ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa permite tanto la formación de moléculas de DNA homodúplex como heterodúplex. La presencia de apareamientos incorrectos en los heterodúplex cambia considerablemente su temperatura de fusión y por tanto su patrón en el gel será diferente a la variante agreste. Si además se introduce un fragmento rico en GC en el producto amplificado, a través de una cola de 40 GC en el extremo 5´ de uno de los cebadores, se consigue detectar mutaciones también en los dominios de alta Tm, incrementando el porcentaje de mutaciones detectables por DGGE hasta casi el 100% (11).

Una ventaja de la DGGE es que el comportamiento de fusión de secuencias de DNA conocidas puede ser simulada por ordenador mediante la utilización de los programas MELT87 y SQHTX. Estos programas, descritos por Lerman y Silverstein (12), permiten realizar un examen preliminar del mapa de fusión de un determinado fragmento de DNA, el tiempo óptimo de carrera y los efectos de un cambio de la secuencia en el mapa de fusión y de sus consecuencias en términos de desplazamiento en el gel.

Si no se conoce la secuencia completa del fragmento en análisis el mapa de fusión puede ser determinado experimentalmente por DGGE perpendicular. En este caso, el gradiente desnaturalizante es perpendicular a la dirección de la electroforesis y la muestra se aplica a lo largo de toda la anchura del gel. La molécula de DNA migrará a través de una concentración constante de agente desnaturalizante con un grado de electroforesis constante. La curva resultante indica el número de dominios de fusión y el porcentaje del agente desnaturalizante en el que ocurre la desnaturalización de cada dominio.

Mediante la técnica DGGE con incorporación de regiones GC se detecta la gran mayoría de cambios puntuales en fragmentos de unos 500 pares de bases con un único dominio de fusión. Sin embargo, cuando se requiere analizar grandes regiones de DNA que contienen dos ó más dominios de fusión, es difícil detectar mutaciones localizadas en las zonas más termoestables. Una de las soluciones incluye la realización de PCR de fragmentos de DNA relativamente grandes (2-3kb) y digerir con enzimas de restricción el producto amplificado antes de hacer la DGGE (13). Otra aproximación consiste en combinar la amplificación simultanea de varios fragmentos de DNA (PCR múltiplex) y la electroforesis en dos dimensiones (TDGS) (14). En este caso los productos amplificados se desplazan a través de un gel con dos gradientes, uno de ellos desnaturalizante (habitualmente 30-80% urea/formamida) y un segundo gradiente de porosidad (generalmente 6.5-12% de poliacrilamida) El incremento progresivo en la concentración de poliacrilamida permite una mayor resolución entre homodúplex próximos y así como compactar las bandas más difusas de heterodúplex.

Si comparamos esta técnica con otros protocolos de detección de mutaciones la DGGE presenta ciertas ventajas. Entre ellas cabe señalar, la alta sensibilidad de la DGGE (mayor que en el caso del SSCP) (15), es más fácil detectar heterocigotos (patrón de 4 bandas), es posible optimizar el análisis mediante simulación por ordenador, se utiliza un protocolo no radiactivo y se puede aislar los alelos mutantes para la determinación de su secuencia. Las desventajas del DGGE pueden ser representadas por el trabajo preliminar laborioso (simulaciones experimentales o computerizadas) antes de que pueda realizarse el análisis de los fragmentos, el uso de cebadores de PCR relativamente largos (~ 60 pb), el tamaño de los fragmentos de DNA que pueden ser analizados eficientemente es limitado (~ 500 pb) y resulta complicado el estudio de genes con un alto contenido en GC.

El protocolo PCR-DGGE ha sido aplicado al análisis molecular de un gran número de loci genotípicos. En genética molecular humana, la DGGE ha resultado ser particularmente útil en el estudio de mutaciones responsables de ciertas patologías como la b -talasemia (16), hemofilia A y B (17,18), y fibrosis quística (19). En genética del cáncer, la identificación de mutaciones germinales y somáticas que tienen lugar en la transformación maligna ha permitido la definición de importantes modelos biológicos como el de la transformación adenoma-carcinoma en cancer colorectal (20). En estos casos la DGGE puede ser empleada para detectar mutaciones en genes susceptibles de degenerar en tumores como k-ras (21), P53 (22), MLH1, MSH2 (23) y APC (24), y monitorizar su acumulación en la progresión del tumor. Además en la actualidad se está valorando la posibilidad de utilizar una variante del DGGE, el TGDS, como técnica de screening para analizar la presencia de mutaciones puntuales asociados con susceptibilidad genética al cáncer, como el BRCA1 y el BRCA2, debido al coste relativamente bajo de esta técnica si la comparamos con la secuenciación directa de estos genes de gran tamaño.