Técnicas diagnósticas

Base de la técnica del PTT

El test de la proteína truncada (Protein truncation test, PTT) (27), también conocido como síntesis de proteína in vitro (IVSP) (28), se diseñó como herramienta para detectar mutaciones (nonsense, frameshift and splice site mutations) que conducen a una terminación “precoz” de la traducción del mRNA. Los primeros experimentos se llevaron a cabo en el estudio del gen de la distrofina.

Por medio de un proceso de transcripción/traducción in vitro se exploran a partir de RNA, regiones codificantes de un gen.

Se distringuen tres pasos importantes (29):

- Retrotranscripción de las muestras de RNA del paciente seguida de una amplificación usando unos primers diseñados específicamente.

- Síntesis in vitro de RNA a partir de los fragmentos amplificados.

- Síntesis de la proteína y análisis por SDS-PAGE. Las proteínas más cortas (proteínas truncadas) se distinguen fácilmente de las proteínas transcritas completamente porque migran más rápido en el gel.

El principio del análisis por PTT se muestra en la figura:



Una de las principales características del PTT es el diseño de un primer sentido especial para amplificar el cDNA. Contiene cuatro regiones diferentes:

- Secuencia del promotor de T7 RNA polimerasa (para la síntesis in vitro del RNA se emplea la enzima T7 RNA polimerasa) en el extremo 5´.

- Brazo espaciador de 5 a 7 pares de bases.

- Secuencia eucariota de iniciación de la traducción: secuencia Kozak que facilita la sínteis protéica.

- Secuencia del gen diana en el extremo 3´ in frame con el codon ATG de la secuencia Kozak.



 

Ventajas e inconvenientes del PTT

Entre las ventajas de PTT cabe destacar que mientras la mayor parte de técnicas para detección de mutaciones se aplican al DNA genómico (explorando los genes exón por exón), PTT se realiza generalmente con RNA, pudiendo analizar segmentos de 1.5 Kb en un solo análisis. El problema radica en amplificar de forma eficaz regiones de varias kilobases.

PTT tambien puede revelar mutaciones que afectan al procesado del RNA (ej. splicing) y además, la longitud de la proteína truncada identifica la posición de la mutación facilitando así su posterior confirmación por análisis de secuenciación.

También existen inconvenientes como el no detectar mutaciones que ocurren fuera de la región codificante y la poca estabilidad de los transcritos que tienen mutaciones que truncan la proteína. Pero el inconveniente que más restringe el uso generalizado de PTT es la dependencia del RNA como muestra de partida porque aparte de ser un material delicado, la expresión de los genes diana en sangre es baja, lo cual requiere técnicas de amplificación. Una solución puede ser el empleo de DNA genómico como muestra, pero es menos habitual.

Los falsos negativos se pueden originar principalmente por dos posibilidades, porque las mutaciones se encuentran cerca del extremo N o C terminal de la proteína o porque no se amplifique el alelo mutado.

Los falsos positivos pueden originarse por artefactos en la retrotranscripción, en la amplificación por PCR o por la existencia de splicing alternativo.

En comparación con otras técnicas de detección de mutaciones, la sensibilidad de PTT es excelente porque detectar alelos mutados en niveles del 5 al 10% no constituye ningún problema, pero si que lo es la caracterización de dichas mutaciones.

Aplicaciones del PTT

- La detección de mutaciones por PTT se ha incrementado por su aplicación en el diagnóstico del cáncer. Se utiliza frecuentemente en la detección de mutaciones en genes supresores tumorales.

Poliposis adenomatosa familiar (FAP) ....................... APC (30)

Cáncer de colon hereditario no polipósico tipo 1 HNPCC1 (31)

Cáncer de colon hereditario no polipósico tipo 2 HNPCC2 (32)

Cáncer de mama .................................. BRCA1 (6), BRCA2 (33)

Cáncer de esófago ......................................................... FHIT (34)

Esclerosis tuberosa tipo 2 ........................................... TSC2 (35)

Neurofibromatosis tipo 1 ................................................ NF1 (36)

Neurofibromatosis tipo 2 ................................................ NF2 (37)

- PTT es muy efectivo para analizar genes ligados a enfermedades en los cuales una parte muy significativa de las mutaciones truncan la proteína.

Ataxia telangiectasia ...................................................... ATM (38)

Distrofia muscular de Duchenne ................................ DMD (39)

Distrofia muscular de Emery-Dreifuss ....................... EMD (40)

Distrofia muscular de Becker ............................................... BMD

Enfermedad del riñon poliquístico tipo 1 ................. PKD1 (41)

- PTT ha encontrado aplicaciones en el estudio de enfermedades en las cuales la mayor parte de las mutaciones genicas son de uno o de pocos tipos de mutaciones muy específicas.

Fibrosis quística CFTR (42) (F508del en el 70% de los alelos)

- Otra aplicación es la investigación de genes ligados a enfermedades

Síndrome de Rubinstein-Taybi ............................ CREBBP (43)

Futuro del PTT

A pesar del uso tan extendido se han hecho pocas modificaciones del protocolo original. Actualmente en muchos laboratorios se utilizan protocolos no radiactivos en la traducción in vitro pero esto no se considera un verdadero cambio.

Rowan y Bodmer introdujeron una mejora significativa, modificaron el primer sentido incluyendo una secuencia que codifica una pequeña proteína, parte del N terminal de c-myc (44). El uso de anticuerpos anti c-myc mejora la eficacia de los sistemas de detección.

La electroforesis de los productos sintetizados es el paso más laborioso del ensayo a la hora de su aplicación a gran escala. La mayor parte de los desarrollos tecnológicos están en esta línea, probablente serán protocolos similares a un ELISA.

Además de analizar la longitud de la proteína sintetizada constituye un punto muy interesante la realización de test funcionales: medir la actividad enzimática o estudiar propiedades de unión al DNA.