Técnicas diagnósticas

Secuenciación como método diagnóstico

El objetivo del Proyecto Genoma Humano (HGP) es descifrar la secuencia del genoma, clarificando, a su vez, la función de las proteínas que codifican los distintos genes. El proyecto genoma produce una gran cantidad de datos y para manejarlos se han creado bases de datos públicas, tales como la del Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), TIGR (http://www.tigr.org), UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene), etc., a la cuales se puede acceder en búsqueda de información sobre la estructura de un gen concreto, la localización cromosómica, los posibles polimorfismos... Estas bases de datos se encuentran en la web con diferentes herramientas de análisis y con enormes posibilidades de búsqueda por algoritmos alternativos en otras múltiples bases de datos (65). El conocimiento de los distintos genes y la implicación de estos en la fisiología humana han dado lugar a una nueva vía de diagnóstico, ya que es conocida la asociación de anomalías en uno o en varios genes con distintas enfermedades. Una de las técnicas más empleada para la detección de cambios de una base (single nucleotide polymorphism, SNP), así como pequeñas inserciones, deleciones, etc., es la secuenciación. Esta técnica, además de detectar anomalías descritas, también permite descubrir alteraciones sin describrir. Las estrategias de secuenciación dependen de la muestra de ADN. Si se quiere secuenciar un gen nuevo, es necesario emplear herramientas complejas de biología molecular, a modo de vector, tales como los plásmidos en caso de tratarse de insertos pequeños, o BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y YAC (cromosomas artificiales de levaduras) en el caso de tratarse de insertos de gran tamaño (100Kb-1Mb). Si lo que se desea es secuenciar un gen conocido, basta con secuenciar productos de PCR de fragmentos de dicho gen, que obtendremos a partir de una muestra de ADN genómico, fácilmente extraíble a partir de sangre. Es por esto, por lo que se puede utilizar la secuenciación, como método fácil, rápido y relativamente barato, como prueba rutinaria, para realizar un screening de polimorfismos en pacientes.

Realización de la técnica

Obtención y preparación de la muestra

Es necesaria la extracción de sangre periférica del paciente. El volumen de sangre necesaria depende del tamaño del gen que se quiera analizar. Se realiza la extracción de ADN genómico por cualquiera de los métodos descritos, siempre y cuando obtengamos suficiente cantidad y calidad de la muestra para asegurar un buen rendimiento de la técnica. Para la amplificación del gen, se debe fragmentar la secuencia según el tamaño del mismo (número y tamaño de los exones). La amplificación de los fragmentos se realiza por la técnica de PCR. Se debe tener en cuenta el tamaño y la estructura de los fragmentos de interés clínico, así como el diseño de los primers (tamaño y contenido de GC) y las condiciones de temperatura y número de ciclos. Optimizar estas condiciones es un requisito para la correcta realización de la PCR. El modo de verificar la amplificación consiste en la visualización del patrón de bandas obtenido tras la PCR. Se puede llevar a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa empleando bromuro de etidio como intercalante. Es importante la purificación de la reacción de PCR para eliminar el exceso de primer, nucleótidos, muestra, etc., que haya podido quedar tras la amplificación.

Reacción de secuenciación

Inicialmente se realizaban dos técnicas diferentes de secuenciación. La primera, denominada método de hidrólisis química fue diseñada por Allan Maxam y Walter Gilbert y parte de un ADN marcado en un extremo de una de sus hebras con 32P (66). La segunda técnica, y más comúnmente empleada, es la denominada terminación de cadena (67), la cual necesita como muestra una molécula de ADN de cadena simple que obtendremos con la desnaturalización del producto de PCR y un oligo complementario a esta cadena de ADN. La enzima ADN polimerasa cataliza la elongación de este primer, tomando como molde la cadena inicial. Esta elongación se realizará añadiendo dNTP (desoxinucleósido trifosfato) hasta la incorporación de un ddNTP (didesoxinucleósido trifosfato), el cual carece del grupo hidroxilo en posición 3´ del azúcar, esencial para la formación del siguiente enlace fosfodiéster. La incorporación de un ddNTP impide la incorporación de sucesivos dNTP o ddNTP. Este paso se repetirá un número elevado de veces (20-35 veces) de modo que, por azar, obtendremos cadenas copia de la muestra de ADN de distintas longitudes con ddNTP que finalizan la cadena. Estos ddNTP estarán marcados y será este marcaje el que nos permita la posterior lectura de la secuencia, realizando una electroforesis en gel de poliacrilamida (Figura 4).

 

Optimización de la técnica

Temperatura de amplificación

La reacción de secuenciación está basada en la repetición de ciclos en los cuales se realizará, sucesivamente, la desnaturalización de la muestra y la elongación del primer. Se requiere la selección de la temperatura correcta para obtener una amplificación específica (68, 69).

Enzima

Es muy importante la elección de la enzima para una reacción óptima. El fragmento Klenow (70) es una ADN polimerasa I que se empleó inicialmente. Esta enzima discrimina, en función de la secuencia, los ddNTP con respecto a los dNTP. La pobre incorporación de ddNTP conlleva una desigual generación de fragmentos de cada base, produciéndose señales heterogéneas que dificultan la interpretación del resultado. Esta discriminación indeseada decrece de modo llamativo al emplear la enzima nativa o modificada T7 ADN polimerasa (71) en presencia de Mn2+. La incorporación de ddNTP y dNTP es más uniforme, mejorando en gran medida la interpretación de los resultados. También ha sido empleada la polimerasa termoestable (Taq) presentando el mismo problema que el fragmento Klenow (72, 73). Este problema fue solucionado al descubrir que esta discriminación era debida a un grupo hidroxilo del aminoácido que se encontraba en el sitio activo de la enzima (en posición 667). La ADN polimerasa I nativa y la Taq ADN polimerasa presentan una fenilalanina (F), mientras que la T7 ADN polimerasa presenta una tirosina (Y). Sustituyendo el aminoácido F por Y en ambas enzimas, disminuye la discriminación de ddNTP entre 250 y 8.000 veces (74). La secuenciación realizada con la enzima Taq ADN Polimerasa F667Y proporciona resultados más homogéneos (75).

Background o ruido de fondo

Es conveniente utilizar la cantidad apropiada de ddNTP marcados para reducir, no sólo el background de fluorescencia, sino también los costes de la técnica.

Marcaje del ADN

Conviene evitar la radiactividad en un laboratorio de rutina porque, la corta vida media, aspectos concernientes a la regulación legislativa y problemas con la distribución y seguridad, son desventajas de los marcadores radiactivos. La forma más empleada de marcaje consiste en fluorocromos (dR6G, dROX, dR110, dTAMRA...) que dan señal de luz tras ser excitados por un láser. Ha sido importante el desarrollo de marcadores con señal de fluorescencia potente que permite la detección de pequeñas cantidades de muestra (76,77).

Electroforesis

La electroforesis en gel, realizada por Sanger, ha sido optimizada ya que requiere mucho tiempo y es de elevado coste. La velocidad de la electroforesis ha sido incrementada con el uso de geles verticales extremadamente finos (100 m m) que permiten un alto voltaje (78). La electroforesis en capilar es otra técnica que acepta alto voltaje acortando el tiempo necesario.

Empleo rutinario de la técnica de secuenciación

Actualmente, la mayoría de las secuencias se obtienen mediante la utilización de secuenciadores automáticos de ADN. Estos aparatos usan uno o cuatro primers marcados o usan terminadores marcados. Generalmente, las aplicaciones se basan en las técnicas didesoxi tradicionales con 4 fluoróforos diferentes (uno para cada tipo de ddNTP) (79) y con ADN polimerasa modificada (80). La secuencia de ADN se analiza leyendo una línea en un gel de poliacrilamida. En un gel de electroforesis podremos analizar varias secuencias (36 o más al mismo tiempo) en distintas líneas del gel. La electroforesis se combina con la detección de los fragmentos marcados con fluorescencia tras la excitación con láser. El detector recoge las intensidades de emisión de las cuatro longitudes de onda diferentes, correspondientes a cada fluoróforo. El análisis informatizado convierte la imagen del gel en la secuencia de bases para cada muestra (electroforograma) (Figura 5). El software más empleado por su seguridad es el phred, ya que parece generar menos errores (40- 50% menos) que el ABI (81, 82). El análisis debe ser minucioso, empleándose todos los métodos posibles para confirmar los datos obtenidos (secuenciación en dos direcciones, PCR óptimo...) antes de dar un resultado falso positivo. La secuencia idónea es aquella en la que los picos de fluorescencia son claros y similares. La imagen típica de un cambio de nucleótido en un solo alelo (heterocigoto) mostraría dos picos de media altura correspondientes a los dos alelos. La imagen de una deleción-inserción sería aquella en la que conviven dos secuencias al mismo tiempo (cada una perteneciente a la secuencia de un alelo) (Figura 6). A pesar de que la completa automatización de los datos procesados es una gran ventaja que probablemente sea factible en un futuro, hasta el momento es necesaria la intervención humana para una correcta interpretación de los resultados.