Técnicas diagnósticas

Detección de mutaciones y polimorfismos mediante tecnología microarray

De acuerdo con las estimaciones, el genoma humano puede contener más de tres millones de de SNPs. Este hecho incrementó la necesidad de desarrollar una tecnología de genotipado de alta resolución a bajo coste. la aparición de los microarrays de oligonucleótidos ha permitido identificar simultáneamente gran cantidad de SNP en un solo experimento a partir de DNA genómico (83), basándose en la hibridación de ácidos nucleicos, técnica capaz de discriminar un emparejamiento perfecto (perfectmatch) entre dos hebras de DNA de un emparejamiento con una base errónea (single mismatch) debido al descenso en la Tm o temperatura de emparejamiento que se experimenta (84).

Un microarray es una disposición ordenada de oligonucleótidos o sondas (spots) en un portaobjetos (slide) de microscopía que nosotros colocamos mediante la utilización de un robot. El diámetro de cada spot es de 150 m por lo que podemos colocar miles de sondas en un solo slide (85). Cada sonda se diseña basándonos en la secuencia que contiene el nucleótido polimórfico. Por cada SNP se diseñarán dos sondas del mismo tamaño y cuya posición central esté ocupada por el nucleótido polimórfico. Así tendremos dos sondas por cada SNP como se puede observar en la figura adjunta. Asimismo se diseñan dos primers que nos permitan amplificar un fragmento que contenga el SNP y que nos servirá para hibridar nuestro slide. Uno de los primers lo marcaremos con un fluorocromo de manera que el producto obtenido de la amplificación por PCR estará marcado y, tras la hibridación con la sonda correspondiente, lo podremos detectar mediante el scanner. Una vez amplificado el DNA que queremos genotipar lo utilizaremos para hibridar nuestro slide. Una vez realizada la hibridación y los lavados correspondientes para eliminar el material no unido o unido inespecíficamente se obtendrá una imagen mediante un scanner confocal que sea capaz de excitar al fluorocromo y recoger la señal emitida por éste, integrándolo en una imagen. Si el DNA amplificado es homocigoto nativo hibridará con la sonda nativa ya que el emparejamiento de nucleótido es perfecto sin embargo formará una ‘burbuja de hibridación’ con la sonda mutada. Tras el experimento obtendremos una imagen donde la señal de hibridación será mucho menor en el spot mutado (figura adjunta). Si el DNA amplificado es homocigoto mutante el resultado obtendremos mayor señal de hibridación en el spot mutado, mientras que si amplificamos un heterocigoto para ese polimorfismo obtendremos idéntica señal en ambos spots.



Para cada SNP que queremos determinar se diseñan sondas como se ha descrito anteriormente y se van depositando sobre el slide ordenadamente pudiendo determinar en un solo microarray miles de SNP (86). De esta manera mediante la realización de una multiplex PCR amplificaremos todas las regiones polimórficas que queramos en una sola reacción de PCR. El producto de la amplificación se utilizará para la hibridación de nuestro microarray.

La detección de snp mediante tecnología microarray utiliza volúmenes mínimos de muestra si lo contrastamos con otros protocolos de genotipaje. Por otro lado, se reducen los costes ya que en solo una sesión de hibridación podemos describir miles de SNP para una mínima muestra de DNA. Esta técnica se ha utilizado con mucho éxito para la detección rutinaria de mutaciones de genes como p53 con mayor éxito que con técnicas convencionales (87) o para la re-secuenciación de genes completos utilizando sondas solapadas que cubran toda la secuencia de un gen (88,89)