Biología Sintética “bottom-up”: Reconstitución e ingeniería de dispositivos macromoleculares funcionales

Rafael Giraldo y Germán Rivas. Departamento de Biología Celular y Molecular Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC.

La célula como una factoría
La Biología Sintética (en lo sucesivo, SynBio) es la más reciente y pujante revolución en el ámbito de las biociencias. "Lo que no puedo crear, no lo entiendo." Esta cita del físico estadounidense Richard Feynman también se puede aplicar a las ciencias de la vida. Originariamente, la investigación en Biología seguía el paradigma de la pura observación y descripción fenomenológica: la materia biológica se examinaba tal y como se encuentra en la Naturaleza. Durante los últimos 60 años, un punto de vista mecanicista se ha establecido en las biociencias, fundamentado en los conocimientos obtenidos en biología molecular y celular: la célula puede ser considerada como una factoría de gran complejidad, que está equipada con "máquinas" que realizan multitud de tareas diferentes. Como tales, las máquinas pueden ser diseñadas, desmontadas y vueltas a armar. En este contexto, la SynBio va más allá de la observación y el análisis de las entidades biológicas para pasar a modificarlas con el enfoque propio de la ingeniería (Fig. 1). Éste implica la aplicación de los principios de no interferencia entre sistemas sintéticos y naturales (ortogonalidad), la estandarización de las piezas y dispositivos bioinspirados, así como la automatización en su fabricación y funcionamiento.

Figura 1

Fig. 1: Analogías y diferencias entre Ingeniería mecánica y SynBio. (A) El despiece y su operación reversa, el montaje, p. ej. de un automóvil es posible gracias a tres principios básicos: abstracción (existencia de un plano o manual de instrucciones), estandarización (las piezas son diseñadas y construidas de manera muy precisa y reproducible) y automatización (una cadena de montaje, con preferencia robotizada). (B) La trasposición de la ingeniería a la SynBio. Si bien conocemos el manual de instrucciones (genoma) de un organismo (en la imagen, la bacteria E. coli) y buena parte de sus componentes macromoleculares (se muestran las estructuras de varias complejos de proteínas) con gran detalle, aún no somos capaces de "leerlos"/interpretarlo en su totalidad. Un reto para la SynBio es la creación de verdaderos estándares en el diseño de componentes biológicos (macromoléculas y circuitos génicos). Las nuevas metodologías de síntesis y ensamblaje de ADN han supuesto un avance fundamental hacia la automatización de los procedimientos bioconstructivos. 

¿Qué significa la Biología Sintética?
La biología sintética pretende diseccionar entidades biológicas en los módulos funcionales que las componen (ensamblajes macromoleculares, células, tejidos, organismos, y sus redes), para ensamblarlos tras haberlos modificado de manera racional, o para diseñar otros totalmente nuevos con el objetivo de implementar funcionalidades no existentes en la Naturaleza (1). Uno de los objetivos generales de la biología sintética es la identificación de una configuración básica mínima, pero funcionalmente suficiente, de un sistema biológico. ¿Qué proteínas y genes, necesita una célula para poder cumplir con sus tareas más importantes -el crecimiento, la reproducción y el metabolismo? Por un lado, mediante la construcción de tales sistemas mínimos y artificiales por medio de un diseño específico, los científicos quieren averiguar cómo las primeras células evolucionaron a partir de la "sopa primordial" inorgánica en la que se habrían formado. Dichas células mínimas (también llamadas proto-células) se describen a menudo como los antepasados de las células que existen hoy en día en la Tierra. Por otra parte, un sistema celular mínimo también podría servir como la plataforma ideal para la implementación de otras funciones con interés tecnológico, tales como la producción de fármacos, la generación de energía o la eliminación de contaminantes.

La SynBio aborda desde dos perspectivas complementarias tanto las preguntas sobre el origen de la vida como los retos relacionados con la optimización de sistemas biológicos para su posible aplicación tecnológicas: bottom-up ("de abajo arriba") - asimilable por analogía al diseño y fabricación de hardware -y top-down ("de arriba abajo")- muy próxima al diseño e implementación de software y redes. La primera (bottom-up) recurre a los ácidos nucleicos (ADN y ARN) como recurso constructivo, echando mano del vasto conocimiento bioquímico, biofísico y estructural acumulado sobre ellos. La segunda (top-down) parte del diseño de circuitos genéticos, cuyos componentes son genes y sus secuencias reguladoras, para implementar operaciones lógicas y, echando raíces en la Biología de sistemas, diseñar tanto nuevas rutas metabólicas como su control genético.

Reconstruyendo los sistemas biológicos "ladrillo a ladrillo"
En el caso de las aproximaciones bottom-up de la SynBio, uno de sus retos es el ensamblaje de nuevas estructuras que deben imitar las funciones de los sistemas biológicos mediante el uso de sus componentes bioquímicos, tales como lípidos, proteínas y ADN. Hoy en día, la comunidad científica considera que un requisito básico para la aparición de la vida - por así decirlo la "célula originaria" - fue la compartimentación en espacios confinados de los componentes bioquímicos primordiales. Por esta razón, uno de los objetivos de estos abordajes sintéticos es la optimización de tecnologías para la producción de compartimentos semipermeables, bien en forma de microgotas o de vesículas de lípidos. En paralelo, se investiga cómo producir un sistema modular de elementos biológicos esenciales que puedan ser encapsulados en dichos compartimentos para llevar a cabo las funciones celulares básicas. De este modo, mediante la estrategia bottom-up, la SynBio se independiza de los microorganismos y puede adaptar específicamente estructuras de nuevo diseño a los requisitos en cada caso pertinentes.

En el contexto de los enfoques bottom-up, la reconstitución de ensamblajes moleculares mínimos es un objetivo atractivo, pero también supone un importante reto experimental, teniendo en cuenta la naturaleza altamente dinámica de la mayor parte de estas máquinas (que, en muchos casos, están asociadas a estructuras de membrana) y la dificultad de ensayar sus reacciones funcionales. Sin embargo, en los últimos años, el progreso en el conocimiento de la organización bioquímica y estructural de estas máquinas moleculares, unido a los avances tecnológicos (en microscopías de alta resolución espacio-temporal y en el análisis de imagen, la producción de sistemas mínimos de membrana, etc.) han puesto este objetivo a nuestro alcance. Por lo tanto, parece razonable esperar que la aplicación de estrategias sintéticas bottom-up permitirá la construcción de ensamblajes moleculares funcionales en el tubo de ensayo a partir de un conjunto mínimo de elementos. Este enfoque sintético será de gran ayuda para verificar (o refutar) conclusiones derivadas del análisis clásico en los niveles molecular y celular y para completar nuestra comprensión de cómo funcionan las maquinarias moleculares.

Durante los últimos cinco años hemos asistido a la explosión del potencial de la SynBio bottom-up. A ello ha contribuido decisivamente la síntesis química eficiente de secuencias de ADN de una longitud cada mayor longitud - hasta abarcar genes y operones enteros - y a precios más asequibles. Nuevas y sofisticadas herramientas para la edición y construcción de secuencias, tanto en el tubo de ensayo como en bacterias y levaduras, son el siguiente nivel en el arsenal con el que la SynBio aborda la ingeniería de genomas. Entre ellas destaca el sistema CRISPR-Cas, cuya primera identificación se debe al español Francisco Mojica en la Universidad de Alicante (2). Gracias a estos desarrollos tecnológicos, es hoy posible el ensamblaje y rediseño de ADN virales o bacterianos completos, como los realizados por Craig Venter (3), o de un cromosoma de levadura por Jeff Boeke (4), ambos grupos en los EE. UU. Otra aportación pionera de SynBio bottom-up proviene del grupo de Jason Chin - Laboratorio de Biología Molecular del MRC, Cambridge, Reino Unido - (5), al asignar un nuevo significado a uno de los tripletes - grupo de tres nucleótidos o "letras" contiguas - que constituyen naturalmente en los ARN mensajeros una señal de terminación. Este avance permite la introducción a voluntad de uno o más aminoácidos no naturales (v.g., con estructuras químicas diseñadas en el laboratorio, no presentes en los seres vivos) en posiciones concretas de la secuencia de una proteína. Este trabajo, junto con la lectura alternativa del mensaje genético como tétradas en vez de tripletes (su marco de lectura natural), implica el haber rediseñado con éxito una maquinaria de traducción verdaderamente ortogonal, paralela a la natural del hospedador. En la actualidad, la incorporación de residuos aminoácidos no naturales en las proteínas - como las realizadas por George Church y colaboradores en los EE. UU. (6) - o de nucleótidos artificiales en el ADN - aproximación seguida por el grupo de Floyd Romesberg también en los EE. UU. (7) - ha permitido desarrollar microorganismos totalmente dependientes de la administración de dichos aminoácidos y/o nucleótidos artificiales en el medio, haciéndolos inviables en el medioambiente en el caso de producirse su liberación accidental en el laboratorio o, en un futuro previsible, en procesos industriales.

Estas aproximaciones se complementan con otras que, desde la Química, elaboran sobre péptidos, polímeros péptido-miméticos y ensamblajes basados en el ADN (origamis) para la construcción de andamios y contenedores bioinspirados sobre los que funcionalizar proteínas de interés. Una contribución adicional y crucial a la ingeniería de proteínas proviene del desarrollo de potentes herramientas informáticas que, fundamentadas en la adaptación para las biomoléculas de los principios de la dinámica Newtoniana y de la mecánica cuántica, elaboran sobre la ingente información libremente accesible en los bancos de datos de secuencias y de estructuras tridimensionales de proteínas y ácidos nucleicos para encontrar similitudes, predecir y modificar estructuras y centros catalíticos, o calcular energías de plegamiento. Con estos mimbres, la bioingeniería molecular diseña variantes mutantes, o quimeras entre proteínas de procedencias, estructuras y funciones diversas, que son utilizadas en la investigación biomédica básica y, como "pruebas de concepto", en procesos con gran potencial biotecnológico. Entre otros, destacan la encapsulación en compartimentos proteicos de enzimas que catalizan pasos sucesivos en un reacción, el diseño de andamios en los que anclar dichas enzimas, la ingeniería de anticuerpos catalíticos e inmunotoxinas, dispositivos optogénicos para el control, mediante la absorción de luz, de la expresión génica, de la actividad de proteínas y de la fisiología celular… una larga lista cuya extensión no cesa de crecer - p.ej., véanse el programa de SynBio que desarrolla la U. de California en Berkeley (8); y la iniciativa MaxSynBio recientemente puesta en marcha en Alemania por la Max Planck Society (9).

Figura 2 Giraldo

Fig. 2: Aproximaciones SynBio "bottom-up" a la reconstitución de un complejo macromolecular funcional en la división celular y a la creación de un dispositivo que genera una amiloidosis modelo en bacterias. (A) Reconstrucción del primer complejo macromolecular (el proto-anillo) de la maquinaria de división (el divisoma) en sistemas mínimos de membrana (nanodiscos, microesferas y bicapas) y en contenedores citomiméticos (vesículas y microgotas). Las proteínas del proto-anillo están coloreadas; el resto de los elementos del divisoma se muestran en gris oscuro. Las esferas grises del esquema superior reflejan el aglomerado interior celular. (B) El proceso por el que el dominio WH1 de la proteína RepA actúa como interruptor entre la represión de la transcripción o en el disparo de la replicación del ADN (arriba) puede ser rediseñado para que RepA-WH1 se ensamble como fibras amiloides (panel intermedio) que resultan citotóxicas para las bacterias. En éstas, como se ve en vesículas lipídicas citomiméticas, RepA-WH1 también puede ensamblarse como poros al interaccionar con la membrana (abajo). Para más detalles, ver refs. (12 y 14).

Biología Sintética "bottom-up" en el CIB-CSIC
En España, la SynBio en sus dos vertientes es hoy practicada por un número creciente de grupos de investigación. Como muestras representativas, valgan el programa de la 2ª Edición de la Escuela de Biología Molecular y Celular Integrativa UIMP-CSIC, celebrada en 2015 (10), o iniciativas como la dirigida por Víctor de Lorenzo en el CNB-CSIC (11). Más específicamente, en nuestros laboratorios en el CIB-CSIC, abordamos la SynBio en su variante bottom-up desde la perspectiva de la reconstrucción de complejos macromoleculares biológicamente significativos en condiciones y entornos citomiméticos:

* La reconstrucción de la maquinaria responsable de la división celular (el divisoma), un problema fundamental en Biología abordado desde la relativa simplicidad de la bacteria Escherichia coli. Nuestro objetivo es la reconstrucción de divisomas funcionales mínimos en compartimentos de membrana que reproduzcan el aglomerado interior celular (Fig. 2A). Combinamos tecnologías bioquímicas, biofísicas y de imagen. Esta estrategia sintética integradora ayudará a completar nuestro conocimiento de los mecanismos que regulan el proceso de la división en bacterias que esperamos también abra nuevas aplicaciones biotecnológicas y farmacológicas (12). Este programa de investigación se realiza en estrecha colaboración con el grupo de Miguel Vicente (CNB-CSIC) (13).

* El desarrollo de un sistema modelo puramente bacteriano de enfermedad amiloide (Fig. 2B), un tipo de proteinopatía que es ajena a las bacterias. RepA es una proteína que actúa naturalmente como represora de la transcripción o como iniciadora de la replicación del ADN de plásmidos, actuando uno de sus dominios (WH1) como interruptor entre ambas funciones. Hemos modificado RepA-WH1 para forzar su ensamblaje en fibras amiloides (polímeros de longitud indefinida formados por monómeros de proteína que interaccionan a través de hebras-), modulándolo mediante su unión a secuencias concretas de ADN. En E. coli la expresión de RepA-WH1 reduce la capacidad proliferativa de las bacterias, generando en éstas un fenotipo similar al envejecimiento. En paralelo, estamos desarrollando distintas herramientas basadas en RepA-WH1 susceptibles de ser utilizadas - en bacterias, levaduras y células humanas - como dispositivos para explorar las rutas generales de la toxicidad de los amiloides, la detección y monitorización de la amiloidogénesis y el cribado de moléculas inhibidoras (14).

URLs de referencia
1. https://www.erasynbio.eu/
2. https://www.youtube.com/watch?v=GOK6FkfmHdQ
3. http://www.jcvi.org/cms/home/
4. http://www.bs.jhmi.edu/MBG/boekelab/
5. http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/group-leaders/a-to-g/jason-chin/
6. http://arep.med.harvard.edu/
7. http://www.scripps.edu/romesberg/
8. http://synbio.berkeley.edu/index.php?page=research-themes
9. http://www.maxsynbio.mpg.de/13480/maxsynbio
10. http://www.uimp.es/agenda-link.html?id_actividad=62IW&anyaca=2015-16
11. http://www.cnb.csic.es/index.php/es/investigacion/departamentos-de-investigacion/biologia-de-sistemas
12. http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=49
13. http://www.cnb.csic.es/index.php/en/research/research-departments/microbial-biotechnology/genetic-control-of-the-cell-cycle
14. http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=61