Introducción a la Metabolómica

Xavier Correig Director Plataforma Metabolómica CIBER en diabetes y enfermedades metabólicas (CIBERDEM) Universitat Rovira i Virgili (URV) Institut d’Investigació Biosanitària Pere Virgili (IISPV)

Introducción

La decodificación  del genoma humano dio lugar a la genómica y a la proteómica, las ciencias que se encargan del análisis global de los genes y de las proteínas, respectivamente. Desde principios de la década de los noventa, ha ido emergiendo con fuerza la metabolómica, la última de las ciencias ómicas (1). Esta ciencia estudia el conjunto de metabolitos presentes en un sistema biológico, en particular en biofluidos como orina, sangre, el fluido cerebroespinal, la saliva o incluso en tejidos o cultivos celulares. Uno de los grupos pioneros en el campo de la metabolómica es el que dirige el Dr. Jeremy Nicholson, del Imperial College de Londres (2), quien acuñó el término metabonómica, definiéndolo como la medida cuantitativa y multiparamétrica de la respuesta de un ser vivo a un estímulo fisiopatológico o a una modificación genética.

Los metabolitos son moléculas de bajo y medio peso molecular (< 1.500 Dalton) que intervienen en los procesos celulares y nos revelan cómo está funcionando el metabolismo en un órgano determinado o en un ser vivo. Nos referimos a los azúcares, aminoácidos, lípidos, etc.  La ausencia o presencia de algunos de estos metabolitos, así como la concentración relativa entre ellos, puede ser un indicador  de estados de enfermedad o de factores de predisposición a ella. Se estima que el número de metabolitos presentes en un ser vivo puede oscilar entre 3.000 y 20.000, mientras que el número de genes se estima en 30.000 y el de proteínas en 100.000. Mientras la genómica y la proteómica nos indican lo que podría haber pasado, la metabolómica nos indica lo que realmente ha pasado y por lo tanto es la ciencia que mejor puede caracterizar los fenotipos de los seres vivos. En el análisis metabolómico intervienen no solamente la expresión de los genes sino también los factores que rodean la vida de un ser como  la alimentación, el ejercicio, el estrés, el ciclo menstrual, el ciclo diurno, etc. Si a una persona que se está ahogando le realizáramos un análisis de ADN, no tendríamos información de la situación límite en la que se encuentra, mientras que un análisis metabolómico lo revelaría de forma inmediata.

Las ómicas son ciencias holísticas, es decir, consideran el mayor número de variables posibles, para posteriormente extraer la información verdaderamente útil de ellas y trabajar en su conjunto. En el caso de la metabolómica, el objetivo es analizar el máximo número de metabolitos posible y seleccionar los que verdaderamente aportan información, a partir de algoritmos de procesado de señal, propios de la inteligencia artificial. Esta aproximación permite un nuevo enfoque en la investigación bioquímica y biomédica, ya que ya no es necesario partir de hipótesis de partida restringidas. Hasta el advenimiento de las ciencias ómicas, cuando se planteaba un experimento se realizaban hipótesis sobre los genes, proteínas y caminos metabólicos clave que interesaba estudiar; pero si la hipótesis de partida era errónea o incompleta, debíamos iniciar un nuevo experimento, con la consiguiente pérdida de tiempo y recursos.  El uso de las ciencias ómicas permite iniciar los experimentos sin hipótesis previas y por lo tanto podemos explorar de forma simultánea diversas vías y rutas metabólicas.  La metabolómica permite clasificar muestras, entender mejor mecanismos bioquímicos, identificar biomarcadores, cuantificar metabolitos en distintos entornos y flujos biológicos, etc.

Podemos decir que se ha constituido en una técnica indispensable dentro de la biología de sistemas, ciencia multidisciplinar que se encarga del estudio sistemático de los flujos e interacciones en sistemas biológicos.

 

Etapas de un experimento metabolómico y plataformas analíticas

En un experimento metabolómico hay que seguir, de forma muy rigurosa, una serie de etapas que se pueden resumir de la siguiente forma:

  • Diseño del experimento
Si incluimos la metabolómica en un experimento, deberemos tener en cuenta, desde del principio, diversos factores. En primer lugar, si queremos que los resultados tengan un significado estadístico, deberemos trabajar con un número de muestras (n) elevado para cada una de las distintas clases definidas. Para que el experimento concluya con éxito, deberemos conseguir que la variabilidad intra-clase sea inferior a la inter-clase. En general es difícil de conseguir porque la variabilidad biológica suele ser muy elevada. Por ejemplo, si deseamos conocer la respuesta de un determinado colectivo humano a un medicamento, la agrupación  de muestras más evidente que obtendremos en primera instancia es por el género. Para evitarlo, podemos segmentar el experimento o bien intentar cancelar, mediante técnicas de procesado de señal, las diferencias debidas al género. El uso de modelos animales es muy útil ya que  podemos disponer de muestras pertenecientes a animales con fenotipos muy parecidos. En esta fase es necesario definir también qué tipo (o tipos) de material biológico es preciso analizar; si pretendemos analizar  la respuesta de un ser humano a un determinado medicamento, quizá el mejor fluido será la orina, mientras que si lo que nos interesa es la evolución de los lípidos, el suero será más adecuado. Otro aspecto clave es la elección de la técnica (o técnicas) analíticas que utilizaremos. El nivel de automatización de las mismas es muy importante cuando el número de muestras es elevado  (superior a 100).

  • Medidas analíticas
La RMN (Resonancia Magnética Nuclear) es una técnica muy robusta y versátil, que permite la medida de un gran número de metabolitos de forma fiable y repetitiva, partiendo de un proceso de acondicionamiento de muestra muy sencillo, y con un nivel de automatización muy alto. El campo magnético de los equipos de RMN utilizados en metabolómica es en general muy alto (superior a 10 Teslas) y existen sondas que permiten la medida en flujos y también en materiales semisólidos (por ejemplo, cultivos celulares, biopsias, tejidos, etc.). La aparición de las criosondas ha permitido llegar a niveles de sensibilidad de mg /mL. En la Figura 1 pueden verse los equipos de RMN de la Plataforma Metabolómica (CIBERDEM-URV). Las técnicas GC-MS (cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas) y LC-MS (cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas) permiten analizar  una gran cantidad de metabolitos a sensibilidades muy superiores a las de la RMN y además, eligiendo el método de separación adecuado, se consigue una gran selectividad. Sin embargo, existen ciertas limitaciones en la falta de estandarización de los métodos, su poca robustez y un tratamiento de muestra tedioso. En determinados experimentos, es deseable la combinación de más de una plataforma analítica.


Figura 1. Equipos de RMN de la Plataforma metabolómica (CIBERDEM-URV)

  • Procesado de señal
La señal obtenida no es utilizable directamente por los algoritmos bioinformáticos, con lo cual es necesario realizar una serie de operaciones básicas (habitualmente llamadas pre-procesado de señal). Éstas incluyen el ajuste del nivel de banda base, supresión de la respuesta del agua (en RMN), alineación de los picos, normalizaciones, selección de variables, etc. Un problema con el que normalmente nos encontraremos es la representación de los datos. En general dispondremos de un número de muestras muy elevado, cada una de ellas con miles de variables, de tal manera que para ser representadas necesitaremos un proceso de reducción de su dimensionalidad. Esto es lo que precisamente hace el análisis de componentes principales (Principal Components Analisys, PCA), ya que genera unas nuevas dimensiones escogiendo las direcciones de máxima varianza de los datos; en general, con 3 o 4 dimensiones (componentes principales) seremos capaces de captar casi toda la varianza de las muestras (ver Figura 2).  Los diagramas de scores  de un análisis PCA permiten observar como se agrupan las muestras en función de la similitud o diferencia de su espectro de RMN y por ende de su metaboloma, mientras que los diagramas de loadings, indican cuales son las variables responsables de tal separación.  La técnica PCA es no supervisada, es decir, el modelo matemático se construye sin tener información  previa acerca de las muestras. Si disponemos de información previa sobre ellas, es posible entrenar al modelo y que aprenda de ellas, de tal manera que puede generalizar la clasificación a partir de muestras desconocidas. El método PLS-DA (partial least square discriminant analysis) se utiliza para esta finalidad. En estos últimos años se está generalizando el uso de métodos estadísticos de correlación STOCSY (statistical total correlation spectroscopy), los cuales son muy útiles para conocer qué metabolito o conjunto de ellos están correlacionados entre ellos (3) (ver Figura 3).

Figura 2. Representación del gráfico de scores de un análisis  PCA del análisis por RMN de suero de individuos controles (B) y después de la administración de un fármaco (T)

  • Identificación de biomarcadores
Para identificar un analito, es preciso que su respuesta en el espectro esté separada de la del resto de metabolitos, o bien seamos capaces de deconvolucionar la señal. En caso positivo, compararemos la respuesta experimental obtenida con la que se halla en bases de datos de metabolitos. En caso de coincidencia, habremos identificado un biomarcador. En caso de duda, se suele recurrir a la comprobación a partir de la medida con estándares. En algunos casos es posible, una vez identificado un marcador, cuantificarlo. En este aspecto, la RMN puede ser muy útil, ya que es una técnica cuantitativa.

Una vez obtenidos todos los datos, hay que valorar científicamente los resultados metabolómicos obtenidos para poder obtener conclusiones y generar valor añadido al experimento biomédico.

Figura 3. Representación del resultado de un análisis 1D-STOCSY en el que se muestra la correlación entre dos señales de un espectro RMN de suero que pertenece a un mismo metabolito

 

Distintas aproximaciones en metabolómica

La primera aproximación consiste en la medida de la huella metabólica en un entorno biológico determinado. Normalmente dispondremos de un espectro de picos obtenido por resonancia magnética nuclear y/o un espectro de masas atómicas, medido por espectrometría de masas. El objetivo es comparar los espectros de distintas muestras aplicando métodos de reconocimiento de patrones, sin necesidad de conocer la naturaleza de los picos de los espectros y por lo tanto de los metabolitos involucrados. De esta forma veríamos como se agrupan las muestras, y nos permitiría separar individuos sanos, de individuos enfermos, y al mismo tiempo podríamos definir grupos a los que asignamos diversos factores de riesgo, en relación a la enfermedad estudiada. Una vez hemos clasificado las muestras, surge una pregunta evidente: ¿cuáles son las regiones del espectro que provocan la agrupación de las muestras? Si somos capaces de asociarlas a determinados metabolitos, estaremos identificando los biomarcadores que intervienen en el proceso.

La segunda aproximación utilizada es el perfilado metabolómico, que consiste en seleccionar, a priori, el  conjunto de metabolitos con los que queremos trabajar, en general los relacionados con una determinada ruta, y analizar cómo evoluciona.  Normalmente es posible identificarlos y cuantificarlos de forma relativa. En el caso en que conozcamos qué metabolitos son clave en el proceso, podremos particularizar el tratamiento de muestra y utilizar la técnica de medida más conveniente para identificarlos y cuantificarlos de forma absoluta. Esta aproximación se denomina metabolic targeting, y se suele aplicar cuando tenemos bien definido el experimento y conocemos los marcadores involucrados en el proceso que estudiamos.

Aplicaciones presentes y futuras de la metabolómica

La metabolómica ha venido aplicándose con éxito en las distintas etapas en el desarrollo de nuevos fármacos (4): a) detección y selección de nuevas sustancias  activas, ya sean de origen natural o bien sintetizadas químicamente, b) medida de los cambios metabólicos generados por ellas en modelos animales y/o en humanos, c) medida de la toxicidad del principio activo y d) comprobación de los efectos sobre la salud del medicamento en poblaciones.

También tiene un enorme potencial en la monitorización de intervenciones nutricionales, a partir de la medida del cambio provocado por un determinado alimento (o régimen) sobre determinados grupos de metabolitos, especialmente los triglicéridos y colesteroles.

La metabolómica se ha revelado también muy eficaz en la monitorización de los transplantes de órganos, ya que a partir de una muestra de orina o suero, permite analizar la evolución de un conjunto de metabolitos que  nos indican, en estadios incipientes,  si se producirá o no el rechazo del órgano implantado.

Un ámbito de aplicación emergente es el diagnóstico de enfermedades, especialmente en cáncer, enfermedades neurológicas y metabólicas.  En un estudio reciente (5) se ha comprobado que la sarcosina es un potencial biomarcador del cáncer de próstata; en el caso de confirmarse el estudio, el impacto clínico sería enorme, ya que podría diagnosticarse la enfermedad a partir de un simple análisis de orina. 

Donde realmente puede ser útil la metabolómica es en la medicina personalizada. Actualmente, cuando elegimos un tratamiento para una persona enferma, conocemos muy poco sobre su fenotipo y sobre las probables reacciones frente al tratamiento elegido. El conocimiento de las variables metabolómicas debería servir para predecir la reacción de un ser vivo a la administración de los medicamento y/o alimentos, de tal manera que el tratamiento podría particularizarse para cada individuo, eligiendo el mejor principio activo y la dosis más efectiva. 

Otro ámbito realmente interesante al que la  investigación metabolómica puede contribuir es la detección de factores de riesgo en poblaciones.  A partir de un análisis de orina (o suero), sería realmente extraordinario poder conocer para un individuo determinado, qué factores de riesgo presenta, a qué tipo de enfermedades está predispuesto (antes de desarrollarlas), y una estimación sobre la probabilidad de desarrollarlas.

Probablemente, para el desarrollo de la medicina personalizada, será necesario trabajar desde la perspectiva de la biología de sistemas, considerando de forma holística no solamente datos metabolómicos sino también genómicos, transcriptómicos, etc. La integración y valorización de esta extraordinaria cantidad de información, es quizá el reto más importante que tiene formulada la investigación en biomedicina.  

 

Bibliografía
(1) Metabolomics: What´s Happening Downstream of DNA, Charles W Schmidt, Environmental Health Perspectives; May 2004; 112, 7; ProQuest Health and Medical Complete pg. A410
(2) Handbook of Metabonomics and Metabolomics, JC Lindon, JK Nicholson, E Holmes, Elsevier 2007
(3) Spectroscopic and Statistical Techniques for Information Recovery in Metabonomics
and Metabolomics John C. Lindon and Jeremy K. Nicholson, Annual Review of Analytical Chemistry 2008.1:45-69.
(4) Applications of Metabolomics in Drug Discovery and Development, David S. Wishart, Drugs RD 2008: 9 (5): 307-322
(5) Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer progression, Arun Sreekumar et al, Vol 457 12 February 2009 doi:10.1038/nature07762

 

Referencias WWW