Splicing alternativos y enfermedad

Juan Valcárcel ICREA y Centro de Regulación Genómica. Barcelona

1. Introducción a los procesos de Splicing y Splicing alternativo
Nuestro genoma se puede asimilar a un libro de instrucciones para construir y mantener nuestro organismo. Las instrucciones de nuestro genoma, sin embargo, están escritas con una sintaxis muy sorprendente. Los mensajes de nuestros genes contienen palabras con significado separadas por letras sin sentido. Para producir una frase inteligible a partir de los mensajes genómicos, las partes sin sentido han de eliminarse y las partes con significado deben ser empalmadas.

El dogma central de la biología molecular establece que las moléculas de ADN que componen nuestros genes se copian en forma de moléculas de ARN, las cuales a su vez se traducen en forma de proteínas. De esta manera, la secuencia de nucleótidos que establece la identidad de una molécula de ADN es descodificada para producir la secuencia de aminoácidos que establece la identidad de una proteína.

Volviendo a la analogía entre los mensajes genéticos y el lenguaje humano, las secuencias del ADN -y de su copia, el ARN- que codifican para aminoácidos están separadas en nuestro genoma por secuencias sin sentido aparente, que han de eliminarse para generar un mensaje genético coherente. El proceso de eliminación de secuencias sin sentido (denominadas técnicamente "intrones") y de empalme de las secuencias codificantes (denominadas "exones") recibe en inglés el nombre de "Splicing" (Figura 1).


Figura 1. La ruta de la expresión génica en organismos multicelulares. Los genes son fragmentos de ADN de nuestros genomas que se copian en forma de precursores de ARN mensajero (Pre-ARNm). Éstos contienen secuencias codificantes (contenidas en exones) separadas por secuencias no codificantes (intrones) que se eliminan por medio del proceso de Splicing para dar lugar a ARN mensajeros maduros (ARNm) que los ribosomas traducen en proteínas. Las proteínas llevan a cabo funciones estructurales y enzimáticas en nuestras células.

En un gen humano típico, la información está contenida en 7-10 exones separados por intrones, donde los intrones son normalmente unas diez veces más largos que los exones. Para llevar a cabo este proceso de corte y empalme, que ha de realizarse con gran precisión y eficacia, existe en el núcleo de nuestras células una maquinaria molecular muy compleja -entre las de mayor complejidad de nuestros organismos- que se conoce con el nombre de "Spliceosoma" (Wahl et al, 2009).

De la misma forma que una sola palabra puede cambiar el sentido de una frase, el proceso del Splicing puede también cambiar el sentido de los mensajes genéticos. Diferentes tipos de células, o una misma célula en distintas situaciones fisiológicas, pueden interpretar una determinada secuencia del genoma como parte de un exón -es decir, como secuencia codificante- o por el contrario como parte de un intrón -es decir, como secuencias a descartar-. De esta manera es posible producir distintos mensajes genéticos a partir de una única secuencia genómica, un proceso que se conoce como Splicing alternativo (Kalsotra and Cooper, 2011).

Más del 90% de los genes humanos experimentan Splicing alternativo. Mediante este mecanismo se producen diferentes proteínas a partir de un gen, en ocasiones llegando incluso a centenares o miles de variantes. El caso más extremo que se conoce es el del gen Dscam de Drosophila, a partir del que pueden generarse más de 38.000 variantes, importantes para la generación de la identidad celular en el establecimiento de redes neuronales (Nilsen and Graveley, 2010). Aunque se desconocen las funciones especificas de la mayoría de las variantes proteicas -llamadas isoformas- generadas mediante Splicing alternativo, existen numerosos ejemplos de cómo las distintas isoformas de un gen muestran diferencias dramáticas en sus propiedades y funciones biológicas (Nilsen and Graveley, 2010; Kalsotra and Cooper, 2011).

Por ejemplo, en el gen del receptor Fas/CD95, implicado en la activación del proceso de muerte celular programada (conocida también como apoptosis), la inclusión o no del exón 6 -que codifica la región de inserción en la membrana de la célula- da lugar a dos isoformas con propiedades radicalmente distintas (Figura 2).


Figura 2. El Splicing alternativo del gen Fas / CD95 controla la muerte celular programada (apoptosis). El exón 6 del gen puede incluirse en ARN mensajeros que codifican para el receptor (Fas R) asociado a la membrana celular, que al unirse al ligando Fas (Fas L) induce la muerte celular programada. Si el exón 6 no se incluye, el ARNm resultante codifica para una forma del receptor que no se asocia a la membrana y que inhibe la apoptosis.

La inclusión del exón 6 da lugar a un ARN mensajero maduro que codifica la versión del receptor que se encuentra unida a la membrana de la célula y que, al unirse al ligando correspondiente, induce la muerte celular programada. Si por el contrario la célula considera el exón 6 como parte de un intrón, el Splicing entre los exones 5 y 7 genera un ARN mensajero que codifica la versión del receptor no unida a la membrana, que es secretada al medio extracelular donde puede unirse al ligando pero sin señalizar al interior celular, inhibiendo el proceso de apoptosis. De esta forma la célula adopta una decisión radicalmente distinta sobre su propio destino (suicidio celular o protección frente a señales que lo inducen) no mediante la transcripción o no del gen, sino mediante el tipo de Splicing alternativo que produce a partir del transcrito primario.

2. Splicing alternativo y cáncer.
El caso de Fas/CD95 descrito en la sección anterior es uno de los numerosos ejemplos en los que el proceso de Splicing alternativo puede modular la función de genes importantes para la transformación tumoral y la progresión del cáncer, contribuyendo a procesos que incluyen desde la proliferación y muerte celular hasta el proceso de formación de vasos sanguíneos en el tumor (angiogénesis) o la migración celular y metástasis a otros tejidos (David and Manley, 2010; Bonnal et al, 2012).

Otro ejemplo paradigmático es el del gen de la piruvato kinasa (PKM), implicado en el mecanismo molecular del efecto Warburg, por el cual las células cancerosas adquieren la capacidad de obtener energía a través de la glicolisis en condiciones aeróbicas, lo que confiere una mayor capacidad proliferativa. El gen PKM contiene dos exones alternativos que son mutuamente excluyentes: el exón 9 se incluye en las células de tejidos adultos, dando lugar a la isoforma PKM1, mientras que el exón 10 se incluye en tejidos embrionarios y en células cancerosas, dando lugar a la isoforma PKM2 (Figura 3).


Figura 3. El Splicing alternativo del gen de la Piruvato Quinasa controla la proliferación de células cancerosas. Los exones 9 y 10 son mútuamente excluyentes. La inclusión del exón 9 da lugar a un ARNm que codifica para la isoforma M1, mientras que la inclusión del exón 10 da lugar a un ARNm que codifica para la isoforma M2. La isoforma M1 se expresa en células adultas, mientras que la isoforma M2 se expresa durante el desarrollo embrionario. La expresión de la forma embrionaria M2 en células cancerosas permite la obtención de energía a través del proceso de glicolisis aeróbica y confiere una mayor capacidad de crecimiento, una característica de las células cancerosas descrita originalmente por el científico alemán Otto Warburg a principios del siglo XX (conocida como "efecto Warburg").

La expresión de la isoforma PKM2 capacita a las células cancerosas para llevar a cabo glicolisis aeróbica (Christofk et al, 2008). Trabajos recientes han establecido que la activación del oncogén c-myc en células tumorales induce la expresión de tres proteínas, hnRNP A1, hnRNP A2 y PTB, que se unen al transcrito primario del gen PKM en la región del exón 9, impidiendo su reconocimiento por la maquinaria de Splicing, permitiendo así la incorporación del exón 10 y la expresión de la isoforma PKM2 (David et al, 2010). Este ejemplo ilustra el acoplamiento fisiológico del proceso de Splicing alternativo con la activación oncogénica y con el metabolismo energético de la célula. También ofrece un ejemplo clásico de los mecanismos implicados en la regulación de Splicing a través de proteínas que se unen al ARN para bloquear -y en otros casos activar- el reconocimiento de determinadas regiones de un transcrito primario por el Spliceosoma.

Estudios recientes enfatizan la relevancia del proceso de Splicing en varios tipos de cáncer y sugieren posibilidades terapéuticas basadas en la modulación de este proceso (Bonnal et al, 2012). Estos estudios tienen como foco una proteína, SF3b1, que es un componente del Spliceosoma. Esta proteína forma parte de un complejo ribonucleoproteico denominado U2 snRNP, cuyo papel en el proceso de Splicing es el de reconocer la región intrónica que precede al exón y permitir que el proceso de Splicing ocurra con eficacia y precisión (Figura 4).


Figura 4. Mecanismo de acción de la droga antitumoral Spliceostatina A (SSA). La figura ilustra el mecanismo normal de reconocimiento de la región 3’ de un intrón por el complejo U2 snRNP (-SSA) y la alteración de este proceso causado por la droga (+SSA). Las secuencias de la región 3’ del intrón contienen un segmento rico en pirimidinas (Y), dos nucleótidos conservados en el extremo 3’ del intrón (AG) y la secuencia reconocida por el complejo U2 snRNP (YNYURAY, Y=pirimidina, R=purina, N=cualquier nucleótido). El complejo U2 snRNP se une al intrón por medio de interacciones de apareamiento entre la secuencia YNYURAY en el intrón y la secuencia GUAGUA presente en el componente de ARN del complejo (U2 snRNA), así como mediante interacciones entre secuencias del intrón y proteínas componentes de la U2 snRNP (SF3b155 -tambien conocida como SF3b1- y p14). La droga Spliceostatina A induce un cambio conformacional en el complejo U2 snRNP que impide interacciones entre las proteínas del complejo y el intrón, permitiendo sólo interacciones RNA:RNA que dan lugar al reclutamiento del complejo en secuencias no funcionales y por tanto inhibiendo el proceso de Splicing. La diferente sensibilidad de distintos intrones a los efectos de la droga da lugar a cambios en Splicing alternativo que afectan a genes implicados en el control de la división celular, explicando así el efecto anti-proliferativo de estos compuestos.

Mutaciones en la proteína SF3b1 se encuentran entre las alteraciones genéticas más frecuentes observadas en neoplasias de células hematopoyéticas como los síndromes mielodisplásicos y la leucemia linfocítica crónica (LLC). En el caso de LLC, la detección de mutaciones en SF3b1 se correlaciona con un peor pronóstico y la aparición de resistencia a quimioterapia (Quesada et al, 2011). Estas observaciones dejan abierta una importante pregunta: ¿por qué mutaciones en un componente básico del Spliceosoma no resultan simplemente en la inhibición del proceso de Splicing y por tanto en toxicidad celular, sino que confieren propiedades particularmente agresivas a determinados tipos de células tumorales?

La pregunta se hace aún más relevante en el contexto de observaciones que indican que compuestos químicos que se unen a SF3b1 poseen propiedades antitumorales, inhibiendo la división celular de células cancerosas en cultivo y restringiendo la progresión tumoral en modelos animales (Bonnal et al, 2012). Varias clases de productos de fermentación bacteriana y compuestos derivados de ellos presentan estas propiedades. Estudios recientes indican que al menos uno de los mecanismos por los que estas drogas actúan está relacionado con cambios que inducen en la precisión con la que el Spliceosoma reconoce las secuencias del ARN importantes para el proceso de Splicing (Corrionero et al, 2011). Estos cambios no resultan en una inhibición general del proceso de Splicing, sino que dan lugar a cambios en Splicing alternativo que afectan particularmente a genes importantes para el control de la división celular, como ciclinas y quinasas asociadas.

La importancia de alteraciones en el Splicing alternativo en la progresión tumoral, la prevalencia de mutaciones en factores de Splicing en ciertos tipos de cáncer y las propiedades antitumorales de drogas cuyas dianas terapéuticas son factores de Splicing sugieren que una comprensión más completa de los mecanismos implicados en este proceso tiene gran potencial para explicar mecanismos moleculares de enfermedades oncológicas y para el desarrollo de terapias innovadoras.

3. Splicing y enfermedades genéticas.
Considerando la importancia fundamental del proceso de Splicing para la expresión génica en organismos complejos y la prevalencia y función biológica de la regulación del Splicing alternativo, no es de extrañar que alteraciones en estos procesos sean causa de enfermedades genéticas. Se ha estimado que alrededor del 15% de las enfermedades hereditarias tienen su origen en la alteración de las secuencias necesarias para distinguir las fronteras entre los exones e intrones (Faustino and Cooper, 2003; Cooper et al, 2009; Singh and Cooper, 2012). Estas secuencias se denominan sitios de Splicing 5’ (las que definen el final de un exón y el principio del siguiente intrón) y sitios de Splicing 3’ (las que definen el final de un intrón y el principio del siguiente exón). Por ejemplo, la mutación de sitios de Splicing o la activación de sitios de Splicing crípticos en intrones del gen de la beta globina es una causa frecuente de una las primeras enfermedades genéticas identificadas, la beta-talasemia. La activación de sitios crípticos resulta en ARN mensajeros con alteraciones en la pauta de lectura que dan lugar a proteínas truncadas no funcionales.

Otro ejemplo de la activación de sitios de Splicing crípticos con consecuencias patológicas se encuentra en la mutación más frecuente encontrada en pacientes con el síndrome de envejecimiento prematuro conocido como Progeria de Hutchinson-Gilford. En este caso la activación de un sitio de Splicing 5’ dentro de uno de los exones del gen de la lamina A produce un ARN mensajero cuya traducción produce una proteína con una delección interna de 50 aminoácidos que tiene efectos drásticos sobre la estructura del núcleo celular y la estabilidad cromosómica.

Estas observaciones tienen dos implicaciones importantes. En primer lugar, la asociación entre patologías genéticas y alteraciones en el proceso de Splicing sugiere que métodos que corrijan la activación inapropiada de sitios crípticos pueden ofrecer terapias válidas para enfermedades hereditarias de difícil tratamiento (Kole et al, 2012). Un ejemplo de ello son trabajos en el grupo del Profesor Carlos López-Otín, en la Universidad de Oviedo, en los cuales oligonucleótidos complementarios al sitio de splicing críptico activado en pacientes con Progeria impiden su activación y por tanto el Splicing aberrante que da lugar a la enfermedad, una aproximación que ha dado resultados prometedores en células en cultivo (Osorio et al, 2011).

La segunda implicación de las observaciones anteriores es que mutaciones en un solo nucleótido pueden generar sitios de Splicing funcionales, ilustrando un principio sorprendente: a pesar de la necesidad de precisión y eficacia en la eliminación de los intrones para la expresión génica, existe una gran diversidad de secuencias capaces de operar como sitios de Splicing funcionales. Esta diversidad es muy acusada en el caso de organismos multicelulares, lo que se interpreta como una respuesta evolutiva a la mayor capacidad de regulación a través de Splicing alternativo en estos organismos (Barbosa-Morais et al, 2012; Merkin et al, 2012).

La diversidad de secuencias que pueden servir como sitios de Splicing ha revelado otro importante principio: además de las secuencias adyacentes a las fronteras entre exones e intrones, otras secuencias localizadas en intrones y exones pueden modular el reconocimiento de los sitios de Splicing, bien facilitando o impidiendo la unión de los componentes del Spliceosoma (Faustino et al, 2003; Cooper et al, 2009). Estas secuencias se conocen como "enhancers" o "silencers" y son reconocidas por complejos de proteínas que frecuentemente están implicados en la regulación del Splicing alternativo. Mutaciones en secuencias "enhancer" o "silencer" pueden también dar lugar a patologías, elevando considerablemente el peso de las alteraciones en el proceso de Splicing como causas de enfermedades genéticas. Por ejemplo, trabajos del grupo de Contxi Lázaro, en el Institut de Recerca Oncologica de Barcelona, estiman que hasta un 50% de las alteraciones genéticas causantes de neurofibromatosis alteran el proceso de Splicing de este gen (Pros et al, 2006).

Para terminar, veremos cómo la atrofia muscular espinal (AME) ejemplifica la relevancia de las secuencias reguladoras de Splicing en patologías humanas y las perspectivas para el desarrollo de terapias innovadoras (Kole et al, 2012; Rigo et al, 2012). La AME es la enfermedad genética más frecuente en países occidentales, y está causada por mutaciones en el gen SMN1, que codifica para una proteína importante para la maduración de los complejos del Spliceosoma. Recientemente se ha descubierto que la deficiencia de SMN1 causa alteraciones en el Splicing del gen Stasimon en neuronas que puede explicar al menos una parte de los defectos neuromotores asociados con esta enfermedad (Lotti et al, 2012).

Una segunda copia casi idéntica del gen, SMN2, está presente en el genoma humano. Sin embargo esta copia no es plenamente funcional -y por tanto no puede rescatar los defectos en el gen SMN1 en pacientes con AME- dado que el exón 7 del gen SMN2 no se incluye eficientemente en el ARN mensajero maduro, a diferencia del exón 7 en el gen SMN1, que sí lo hace. Una diferencia de un solo nucleótido entre los exones 7 de SMN1 y SMN2 explica la diferencia en la inclusión del exón entre los dos genes. El efecto del nucleótido diferencial se ha atribuido a una disminución en la afinidad de unión de una proteína estimuladora de Splicing y/o un aumento en la afinidad de una proteína inhibidora de Splicing. Este ejemplo demuestra la sensibilidad del proceso a multitud de secuencias auxiliares y a la actividad de factores antagónicos.

Basándose en detallados estudios mecanísticos, el grupo del Profesor Adrian Krainer, en el Cold Spring Harbor Laboratory, ha desarrollado terapias experimentales en modelos animales para la corrección del Splicing del gen SMN2 y por tanto para la restitución de la función de la proteína SMN en células deficientes en el gen SMN1. De modo similar a la inhibición de secuencias crípticas utilizadas para la corrección de la Progeria que vimos más arriba, este grupo utilizó oligonucleótidos complementarios a una secuencia intrónica que tiene un efecto silenciador sobre el exón 7 del gen SMN2 para estimular su incorporación en los ARN mensajeros maduros y así restituir los niveles de la proteína SMN en neuronas de ratones con varios modelos de AME (Hua et al, 2010). A pesar de potenciales dificultades de esta aproximación, resultados recientes indican que modificaciones químicas pueden conferir una gran estabilidad a los oligonucleótidos utilizados y que incluso la administración periférica de estos compuestos tiene efectos terapéuticos notables (Hua et al, 2011). Estos prometedores resultados han posibilitado la iniciación de ensayos clínicos, con grandes expectativas para el tratamiento de esta enfermedad que hoy es incurable.

Como resumen, la sintaxis partida de nuestros mensajes genéticos se ha aprovechado evolutivamente para ampliar el abanico de funciones de nuestros genes y sus posibilidades de regulación. A su vez, alteraciones en estos mecanismos están en la base molecular de enfermedades genéticas y de patologías complejas como el cáncer. Estudios recientes sugieren que la modulación del Splicing ,mediante drogas dirigidas contra componentes del Spliceosoma o mediante oligonucleótidos dirigidos contra secuencias implicadas en la regulación de Splicing, ofrece terapias innovadoras muy prometedoras.

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