Los conocimientos sobre el genoma humano hace posible la utilización de tecnologías en genómica y proteómica, capaces de analizar la diversidad y complejidad de cada tipo de cáncer, enfocadas hacia el diagnóstico molecular de tumores, adecuando la terapia a cada paciente, y contribuyendo a la identificación de genes relevantes en cáncer esporádico y familiar1.

De interés particular es la aplicación de los sistemas de análisis molecular masivo a la predicción de respuesta a tratamientos individuales. Numerosos estudios han demostrado la capacidad de generar estos modelos predictivos aplicados a supervivencia, metástasis, respuesta a tratamientos concretos2-5 . Todos ellos, en mayor o menor grado, adolecen del mismo defecto, la insuficiente reproducibilidad de los resultados generados, cuando son aplicados en un contexto distinto; es decir en otros centros, por otros especialistas, o usando una tecnología diferente4,6.

Sistemas de análisis molecular masivo.

Matrices tisulares (tissue arrays)
Permite utilizar en bloques parafinados sistemas de análisis masivo. Para ello crea un nuevo bloque de parafina en el que se insertan en posiciones predefinidas hasta 800 cilindros de 600 a 1000µ, procedentes de biopsias de aguja efectuadas sobre bloques de parafina preexistentes.
Es un sistema adaptado para investigar un marcador o un panel de marcadores relacionados en una serie amplia de muestras, útil en IHQ, FISH, HIS; complementario a microarrays de cDNA. Indicaciones típicas de esta técnica son control de calidad, análisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de cánceres de pequeño tamaño, establecimiento de modelos predictivos basados en expresión de proteínas.

La posibilidad de digitalizar el resultado de las inmunotinciones, así como de cuantificar la expresión de una marcador preciso abre el camino de un uso más ambicioso de las matrices tisulares (MTA)7,8.

SNPs
Variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debidas a sustituciones de una base. Hay actualmente descritos por encima de tres millones en todo el genoma -SNP Consortium (TSC) & Human Genome Project (HGP)- , con una densidad mínima de 1 SNP/1.9 kb. De ellos, hay 60.000 SNPs en exones, lo que refleja una mayor densidad de los mismos en regiones exónicas, más investigadas, hasta una densidad de 1 SNIP/1.08 kb. El numero de polimorfismos existente esta en el rango de 10 a 15 millones por individuo9,10.

El análisis de SNPs permite realizar estudios de genética de poblaciones, estudio de genes candidatos para asociación con enfermedades precisas, análisis de resistencia a fármacos, sensibilidad/toxicidad a drogas, así como informar de la predisposición individual a contraer enfermedades complejas, multigénicas 9,10. Así la mejora en las posibilidades de detección masiva de polimorfismos abre el camino a estudios que relacionen variabilidad genética con riesgo a formas precisas de cáncer y sensibilidad individual a drogas.

CGH-Arrays
Hay diferentes opciones para arrays de CGH, esencialmente BACs u oligonucleótidos. BACs son cromosomas artificiales humanos conteniendo secuencias de DNA de longitud variable entre 100 a 200 kb. Hay actualmente clones disponibles para todo el genoma, que cubren el genoma con una alta densidad. Su uso permite el diagnóstico preciso de deleciones, duplicaciones, inserciones y reordenamientos. La disponibilidad de miles de BACs ha permitido el desarrollo de chips de BACs (CGH-arrays), que permiten detectar duplicaciones y deleciones con una sensibilidad de 100 Kb11. Para ello se realiza hibridación comparativa entre DNA de un paciente/DNA sujeto sano, o DNA tumoral/DNA constitucional. Un ejemplo de ello es la reciente publicación de un array de BACs especifico para la LLC-B, desarrollado por P Lichter12.

Existen también microarrays comerciales de CGH basados en oligonucleótidos, con resolución más fina que los basados en BACs y un alto potencial en investigación y diagnóstico13.

Matrices de cDNA (Oncochip) u oligonucleótidos
Un microarray de DNA es un sistema miniaturizado donde fragmentos de DNA se inmovilizan en soportes sólidos. Desde un punto de vista de longitud de la sonda usada, hay 2 tipos de microarrays de DNA: microarrays de cDNA que presenta sondas de cientos de bases y arrays de oligonucleótidos con sondas de 20-25 bases o 50-80.

Estos chip o microarrays consisten en un soporte sólido, por ejemplo un portaobjetos, sobre el que un robot ha impreso de manera ordenada miles de cDNAs específicos (u oligonucleótidos) representantes de otros tantos genes. Por analogía con el término chip micro-electrónico (dispositivo con una alta densidad de circuitos electrónicos), en biología molecular también se ha utilizado el término de biochip de expresión para denominar a los arrays de DNA, ya que son dispositivos de pequeño tamaño (chip) en los que se alcanza una gran densidad de material biológico (bio) inmovilizado sobre una superficie sólida. Un chip puede ser hibridado simultáneamente con dos sondas de cDNA marcadas diferencialmente (por ejemplo con los fluorocromos Cy3 y Cy5) generadas a partir del RNA mensajero de las muestras a comparar (por ejemplo, tejido normal versus tejido tumoral), o bien ser marcado con un único fluorocromo.

Después de la hibridación, y utilizando un scanner, puede medirse para cada spot de cDNA la intensidad de cada uno de los fluoróforos, siendo el nivel de señal detectado proporcional al número de copias de mRNA en la muestra; de modo que el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constituye una medida de la expresión génica diferencial relativa al cDNA representado en el chip (“ratios” de expresión).

El alto grado de integración del array permite, en un solo ensayo, obtener multitud de valores de expresión génica relativa para distintas condiciones biológicas, lo que convierte a esta técnica en una herramienta de alto rendimiento para trabajos en el área de la genómica funcional. El gran volumen de datos generados debe ser tratado con herramientas y métodos bioinformáticos14,15.

Análisis de resultados de microarrays.

Los datos generados en estos experimentos precisan de análisis bioinformático, que esencialmente pretenden:
• agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada.
• Identificar genes cuya expresión se asocia a eventos específicos
• Asignar función biológica a los genes resultado del experimento
• Identificar cambios tiempo-dependientes, ordenados a los largo del tiempo.
• Simplificar series de genes al mínimo numero de datos posible.
• Asignar riesgos específicos derivados de la expresión de genes concretos.

Diversas herramientas informáticas están disponibles para este objetivo; entre otras las desarrolladas en el CNIO (GEPAS) y alojadas en la pagina web: http://gepas.bioinfo.cnio.es/index.html

Limitaciones de los microarrays de DNA:
Como otras técnicas usadas en investigación, los microarrays tienen limitaciones, como:

1. Secuencias no verificadas. Hay un proceso constante de reasignación y edición de las secuencias inicialmente descritas. No obstante, las últimas versiones de los sistemas más comercializados contienen muy escasos errores de asignación.

2. Dificultad de trasladar datos cuantitativos a estados funcionales. No necesariamente niveles altos de expresión de ARN o proteína implican activacion funcional del gen preciso, y de hecho ocasionalmente implican secuestro o anulación funcional. En este sentido, conclusiones elaboradas a partir de datos generados por estudios de microarrays deben de ser entendidos como hipótesis necesitadas de verificación experimental.

3. Ruido biológico. Sistemas celulares críticos están caracterizados por una alta redundancia. En parte, la variabilidad Inter.-experimental es dependiente de fenómenos azarosos, u oscilaciones cíclicas, no relacionadas con el objeto del experimento.

4. Falta de estandarización de técnicas de análisis. La mayoría de las plataformas usadas para análisis genómico han alcanzado un alto gado de robustez, pero aún adolecen de una reproducibilidad subóptima, cuando los resultados obtenidos con diversas plataformas son comparados entre sí. El imprescindible gold standard en validación de datos sigue exigiendo comprobar el valor de los datos obtenidos en una nueva población de casos.

PCR cuantitativa
Aunque sobre un numero menor de genes, existen actualmente plataformas comerciales que permiten investigar un numero limitado de genes en sistemas de PCR a tiempo real, dotados de una alta sensibilidad y reproducibilidad. Adicionalmente, datos cada vez mas numerosos muestran que esta técnica es aplicable, en determinadas condiciones, a RNA extraído de material parafinado.

El carácter multigénico de alguno de estos análisis (realizados sobre plataformas o tarjetas de hasta 384 pocillos) ha llevado a su denominación como chips de baja densidad.

La alta reproducibilidad de estos experimentos facilita la expansión de esta tecnología y su uso en la aplicación clínica de datos surgidos de análisis realizados con microarrays de alta densidad. Así existen en la actualidad diversos ensayos clínicos enfocados a la predicción de respuesta a terapia basada en datos de expresión obtenidos con PCR en tiempo real, por ejemplo en carcinoma de mama.

Detección de proteínas como marcadores séricos
Múltiples grupos de investigación coinciden en el objetivo de identificar marcadores séricos informativos de riesgo de contraer enfermedades específicas, o adecuados apara el seguimiento de enfermedad residual mínima16 . La idea no necesita apenas justificación, el análisis de suero es una técnica mínimamente invasiva, que permite monitorizar con frecuencia cambios previos al diagnóstico clínico o a lo largo de la enfermedad . Resultados iniciales obtenidos en cáncer de ovario, páncreas o próstata alentaron esta línea de trabajo, usando SELDI-TOF-MS. Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja reproducibilidad y una elevada tasa de falsos positivos, lo que prejuzga su uso como técnica de análisis rutinario en análisis de poblaciones a riesgo de contraer enfermedades específicas17,18.

Detección de fosfoproteínas en células individuales
Recientes datos experimentales coinciden en que tanto el mecanismo de acción de drogas, como la sensibilidad a las mismas, es desvelado con mayor precisión recurriendo a análisis de proteínas inducidas por la acción de estas drogas, bien en modelos o pacientes. Así agentes que dañan el DNA inducen fosforilación de sensores de daño a DNA, mientras que agentes cuya diana está constituida por rutas de traducción de señal inducen cambios en el estado de fosforilación de proteínas críticas en estas rutas. La disponibilidad de anticuerpos contra diferentes estados funcionales de estas proteínas permite usar la citometría de flujo como técnica de análisis de estos cambios, con la ventaja de que esto nos permite reconocer la existencia de cambios sutiles en subpoblaciones celulares minoritarias19-21.

Aplicaciones en farmacogenómica

Las matrices de cDNA permiten también establecer el llamado perfil genómico de un fármaco, o firma molecular del mismo, además de establecer firmas moleculares predictivas de sensibilidad/resistencia. Aunque desde un punto de vista clínico, tiene mayor interés identificar marcadores iniciales, al diagnóstico, de sensibilidad a drogas precisas, alcanzar este objetivo tropieza con los mecanismos de acción múltiples de la mayoría de las drogas en uso, así como con la existencia de múltiples sistemas redundantes de promoción de la supervivencia de las células neoplásicas. En la práctica, se ha demostrado que los cambios inducidos por drogas son más informativos que alteraciones moleculares al diagnóstico 3. Estos cambios pueden ser analizados in vitro -células tumorales expuestas a la acción de drogas precisas- o in vivo – cambios en el tiempo en células leucémicas tras tratamiento-.

De hecho, el tratamiento con un fármaco concreto de una línea celular específica permite identificar el conjunto de genes inducidos en respuesta a ese fármaco. Estos genes muestran variabilidad en función de la droga, estirpe celular, alteraciones génicas precisas e intervalo de tiempo transcurrido hasta el análisis. Su conocimiento permite proponer mecanismos de acción de una droga precisa.

Uno de los objetivos en análisis farmacogenómico es la identificación de pacientes sensibles o resistentes a drogas concretas. La resistencia a una droga depende de múltiples factores, incluyendo sobreexpresión de genes de resistencia a drogas, incremento en la reparación de DNA, o alteraciones en la sensibilidad celular a quimioterapia afectando a múltiples rutas. Marcadores de resistencia o sensibilidad identificados en modelos experimentales en el laboratorio o en pacientes aislados pueden perder interés cuando se estudian sobre series largas de pacientes. Consecuentemente, es preciso analizar la relevancia clínica de los genes así identificados en series de pacientes tratados de forma randomizada.

Una aplicación extremadamente relevante de estos estudios es la identificación de dianas terapéuticas y el análisis de rutas. Esencialmente la información derivada de estos estudios brinda la oportunidad de proponer nuevas dianas que, después de validación experimental, permitan el desarrollo de drogas racionalmente dirigidas.

Futuro en la aplicación de técnicas de genómica y proteómica
El alto potencial aplicado a investigación y diagnostico de estas técnicas aun precisa de numerosos estudios adicionales, previamente a su aplicación clínica masiva. Este carácter novedoso y el alto nivel de complejidad de estos experimentos queda subrayado por el hecho de que aun se publican muchas más revisiones o comentarios editoriales sobre técnicas de genómica y proteómica que resultados originales. No obstante, cabe esperar que la aplicación clínica de estas técnicas siga en incremento, cubriendo primero una etapa de identificación de marcadores diagnósticos y, posteriormente, propuesta y validación de dianas terapéuticas. El desarrollo de estas técnicas de análisis molecular masivo, al mismo tiempo, está ofreciendo un reto para el desarrollo de sistemas de análisis estadístico de múltiples variables y validación de datos.